مقدمة لمختبر دودة : من الديدان إلى التثقيف الطفرات

Summary

الكشف عن العيوب المظهرية مع المسوخ هو طريقة مباشرة لتحديد الجينات التي تعمل في عملية بيولوجية معينة. في هذه المادة ونحن تصف كيفية الديدان الثقافة الحية الحرة (على سبيل المثال ،

Abstract

يصف هذا البروتوكول الإجراءات للحفاظ على الديدان الخيطية في المختبر وكيفية mutagenize عليها باستخدام طريقتين البديل : إيثيل سلفونات الميثان (EMS) و 4 "5 ، 8 trimethylpsoralen مقرونة الأشعة فوق البنفسجية (TMP / الأشعة فوق البنفسجية). الديدان الخيطية هي النظم البيولوجية قوية لدراسات علم الوراثة بسبب خطتهم بسيطة الجسم ونظام التزاوج ، والذي يتكون من المخنثين المصير التسميد والذكور التي يمكن أن تولد المئات من النسل للحيوان الواحد. تتم المحافظة على الديدان الخيطية في لوحات تحتوي على الحشيش. آغار من البكتيريا ويمكن نقلها بسهولة من لوحة إلى أخرى باستخدام الاختيار. EMS هو وكيل مؤلكل تستخدم عادة للحث على الطفرات والحذف نقطة صغيرة ، في حين TMP / الأشعة فوق البنفسجية يؤدي الى الحذف أساسا. اعتمادا على نوع من الديدان الخيطية المستخدمة ، وتركيزات EMS و TMP يجب أن تكون الأمثل. لعزل الطفرات المتنحية من الديدان الخيطية Pristionchus pacificus ، تم فحص الحيوانات بصريا للجيل F2 عن الظواهر. لتوضيح هذه الأساليب ، نحن mutagenized الديدان وبحثت عن غير منسقة (UNC) ، المسوخ (الهيئة) بدين وقصير (Dpy) والمحولات.

Protocol

الجزء 1 : إعداد وسائط النمو الخيطية (NGM) لوحات بتري

الديدان الخيطية التجريبية مثل ايليجانس جيم و P. عادة ما يتم تربيتها في المختبر pacificus في 6 لوحات تحتوي على نيماتودا بيتري الطول متوسطة النمو (NGM) ^1. يتم الاحتفاظ الديدان في 20 درجة مئوية ، ولكن يمكن المحتضنة في مجموعة من درجات الحرارة (بين 4 درجات مئوية -- 25 درجة مئوية) ، تبعا للأنواع الديدان الخيطية والتصميم التجريبي. لإعداد لوحات مع NGM والتقنيات القياسية عقيمة لا بد من استخدامها لمنع التلوث الفطرية والبكتيرية. التالي هو بروتوكول لإعداد لوحات NGM :

1. وزن 15 ز آغار ، 2.4 غرام كلوريد الصوديوم ، 2 ز تريبتون ، و2،72 ز KH ₂ PO ₄ في دورق مخروطي L 2 ، وجعل حجم ما يصل إلى 1 لتر مع الأوتوكلاف ، والمياه ، والسماح لتبرد إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي.
2. إضافة 0.8 مل من كل CaCl M 1 ₂ ، والكولسترول (5 ملغ / مل في الإيثانول) ، و 1 م MgSO _4. وسعها لمنع تلوث الفطرية والبكتيرية ، 1 مل ستربتوميسين (100 ملغ / مل) ، والنيستاتين 1ml (10 ملغ / مل) يمكن ان تضاف الى كل ليتر من المتوسط.
3. باستخدام جهاز Unispense والحفاظ على ظروف معقمة ، يصب في وسائل الاعلام على لوحات المطلوب. ينبغي أن تملأ لوحات لنحو 2 / 3 ^الثالث كامل. وهناك معيار قطرها 60 ملم لوحة يتطلب حوالي 10 مل من وسائل الإعلام. لا تتحرك لوحات حتى يتم gelified تماما آغار ، وإلا سيكون هناك تفاوت سطح آغار ، مما يجعل من الصعب التركيز على stereomicroscope الديدان.
4. مرة المجففة ، ويمكن لوحات المصنف مباشرة أو تخزينها في 4 درجات مئوية حتى مع بذر البكتيريا.

الجزء 2 : إعداد OP50 البكتيريا وبذر NGM وحات بيتري

هو مثقف P. pacificus في المختبر من خلال تغذيتها على سلالة OP50 القولونية. OP50 لديها نمو محدود على لوحات NGM ، وبالتالي تكوين حشيش رقيقة يسهل تصور من الديدان ^1. أن تنمو ثقافة OP50 ، استخدم LB - مرق :

1. إضافة 5 ز bactotryptone ، خلاصة الخميرة 2.5 و 2.5 ز ز كلوريد الصوديوم إلى 500 مل زجاجة كأب المسمار ، يشكلون وحدة التخزين إلى 500 مل بالماء المقطر والأوتوكلاف.
2. تحصين مرق مع مستعمرة واحدة من OP50 من لوحة الثقافة تحت ظروف معقمة وتركها تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
3. LB - OP50 مستعد لاستخدامها ، ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أشهر إذا استمر العقم. كلما لوحات تحتاج إلى المصنف ، صب كمية صغيرة من المرق في الدورق معقمة صغيرة ، وهذا سيساعد على منع التلوث من ثقافة الأسهم.
4. لوحات البذور ، والاستغناء عن 100-120 ميكرولتر من OP50 على القطر 60 ملم لوحة بيتري NGM ودوامة لانتشاره.
5. احتضان هذه اللوحات المصنفة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لالعشب ينمو. ويمكن الآن هذه اللوحات المصنفة يتم تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع. تخزينها في وضع مقلوب يساعد على منع الجفاف السريع.

الجزء 3 : جعل معول

في هذا القسم ونحن تصف كيفية جعل لالتقاط الديدان. يستخدم لنقل التقاط الديدان من موقع إلى آخر. يتم اختيار من 30 سلك قياس 90 ٪ من البلاتين إيريديوم 10 ٪ ، رغم أن بعض الباحثين قد تفضل التراكيب المعدنية مختلفة قليلا :

1. قطع حوالي 3-4 سم من الأسلاك ، ومكان منه 0.5 سم داخل غيض من ماصة باستير (الذي تم كسره تلميح إلى أصغر والطول) ، ثم ختم ذلك في الزجاج فوق الموقد بنسن. طول السلك يبرز من الزجاج حوالي 3-3،5 سم ، ولكن يمكن أن تختلف وفقا لتفضيلات الفردية.
2. تتسطح نهاية السلك الذي جاحظ باستخدام مطرقة أو كماشة. ينحني ثم صعودا جزء بالارض لتشكيل حلج القطن.
3. تنعيم حواف حادة للاختيار مع ورقة الرمل لمنع تلف أو أغار على دودة.

الجزء 4 : الديدان الإلتقاط

1. لالتقاط الديدان وتعقيم سلك البلاتين على اللهب وسحب الطرف المسطح لبيك على طول العشب البكتيرية إلى معطف غيض مع البكتيريا لزجة سميكة ، مع الحرص على عدم ثقب أو تلف سطح آغار.
2. باستخدام stereomicroscope ، جدا الفرشاة بخفة غيض زجة ضد الديدان دودة / ويمكن الحصول حتى على دودة العصي على البكتيريا على الاختيار.
3. مرة واحدة على الدودة غيض من اختيار ونقل على الفور إلى لوحة جديدة عن طريق لمس أو انزلاق غيض من التقاط ضد العشب البكتيريا من لوحة جديدة ، والدودة ينبغي إيقاف الزحف. ويجب الحرص على عدم الاضرار سطح أغار على لوحة أخرى الديدان تزحف في ثقوب مما يجعل من الصعب استردادها. إذا الدودة يبقى على اختيار لفترة طويلة جدا ، فإنه قد يجفف.

الجزء 5 : EMS الطفرات

إيثيل سلفونات الميثان (EMS) يحرض طائفة واسعة من طفرات في الجينوم في 2. يمكن التعرف على المسوخ عن عيوب مثل وضع البيض ، وعيب العضلاتق ، وتحديد الجنس ، وتشكيل dauer ، والسلوك ، وتشكيل الغدد التناسلية. بروتوكول لالطفرات EMS مماثلة لتلك التي وصفها لجيم ايليجانس ^1.

1. تحضير 500 مل (أو أكثر) من هيدروكسيد الصوديوم 1N.
2. تأخذ 4-5 ، 6 سم القطر بيتري لوحات كاملة من الديدان ، والتي تحتوي على بضع مئات من الديدان في الأحداث اليرقات الثالثة (J3) المرحلة ، ويغسل قبالة الديدان باستخدام 2-3 مل من M9 معقم لكل لوحة.
3. جمع كل الديدان في ، القابل للتصرف العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5-7 دقائق أو حتى الديدان تشكيل بيليه.
4. نضح السائل واستخدامها 2 مل من M9 لإعادة تعليق الديدان. إضافة إلى 20 ميكرولتر EMS أنبوب يحتوي 2ml من M9 ويهز حلها. ثم يضاف هذا الحل EMS إلى 2ml التعليق دودة ودوامة بلطف. وسوف تركز النهائي EMS يكون 47 مم. الحذر : EMS هو المغير قوي جدا ويجب التعامل معها في غطاء الدخان. ينبغي أن يعامل جميع المواد (قفازات ، ماصات ، نصائح) التي تأتي في اتصال مع هذا المغير مع هيدروكسيد الصوديوم 1N إلى EMS والخاملة. ارتداء قفازات مزدوج خلال الإجراء بأكمله الطفرات EMS. تخلص من النفايات الخطرة وفقا لمبادئ توجيهية مؤسستكم.
5. وضع أنبوب الطرد المركزي وتغطية سقف مع parafilm ؛ ضعه أفقيا في غطاء الدخان والسماح للديدان احتضان مقابل 3.5 ساعة. ويمكن أيضا أن يوضع أنبوب على سرعة منخفضة الروك.
6. تشغيل الأنبوب وتغطية سقف مع parafilm ؛ ضعه في وضع عمودي واحتضان حتى تغرق الديدان.
7. نضح في وطاف تخلص منه في كوب / قارورة تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم 1N. هذا سوف يعطل نظام الإدارة البيئية.
8. إضافة إلى 5 مل M9 الديدان ، عكس الأنبوب 25-30 مرات لغسل الديدان ، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة دقيقة أو حتى 5-7 الديدان تشكيل بيليه. نضح في وتجاهل طاف في الدورق 1N هيدروكسيد الصوديوم.
9. كرر الخطوة غسل ما لا يقل عن 3 مرات.
10. بعد غسل النهائي ، وإعادة تعليق بيليه دودة في الحد الأدنى (~ 500 ميكرولتر) من M9 وماصة بها على لوحات تحتوي على NGM حشيش OP50 البكتيريا. في هذه النقطة التي لم تعد بحاجة إلى العمل في هود الكيميائية.
11. اسمحوا السائل الجاف لبضع دقائق ثم واختيار ونقل سليم يبحث J4 اليرقات لوحات المصنف الطازجة. تجاهل لوحة أصلية وفقا للمبادئ التوجيهية مؤسستكم النفايات الخطرة.
12. ترك النفس الديدان mutagenized إخصاب. باستخدام stereomicroscope ، شاشة الظواهر جيل F2 للالمسوخ المتنحية من الفائدة.

الجزء 6 : سورالين الطفرات

في هذا القسم ونحن تصف إجراءات استخدام الطفرات TMP بالتزامن مع الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة (UV). ويستخدم على نطاق واسع TMP / الأشعة فوق البنفسجية طريقة للحث على الطفرات طفرات الحذف داخل الجينوم ^3.

1. جمع الديدان 4-5 ، 6 سم القطر لوحات بتري في أنبوب الطرد المركزي 15 مل كما هو موضح في الإجراء السابق.
2. إضافة 10 مل M9 ، عكس 20 مرة لغسل الديدان ، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وتكرار الغسيل لما مجموعه 3 مرات. نضح السائل وإعادة تعليق الديدان في 10 مرات عن حجمها من M9 يحتوي على 30 ميكروغرام / مل من TMP. 20 ماصة ميكرولتر من TMP (3 ملغ / مل) في 2 مل من M9. مثل EMS ، TMP هو مادة مسرطنة قوية ، ويجب التعامل مع اتخاذ تدابير السلامة المناسبة. وينبغي لمنع الخطر المحتمل من من العين السليمة للأشعة فوق البنفسجية ضوء ترتدي استخدامها. يجب تجاهل المستهلكات في أكياس واقية مناسبة.
3. احتضان الأنبوب في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز سرعة منخفضة (40 UPM). تعيين أنبوب غطت عموديا لمدة 10 دقائق للسماح للجميع مصدر الديدان.
4. إزالة الديدان من الجزء السفلي من أنبوب مع ماصة باستير ونقلها على لوحة NGM غير المصنف. تجاهل المبادئ التوجيهية التالية طاف مؤسستكم الكيميائية الخطرة.
5. الحفاظ على لوحة في الظلام حتى يتم امتصاص فائض TMP في لوحة.
6. باستخدام مقياس كثافة الأشعة فوق البنفسجية ، تعيين المسافة بين مصدر الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة وطبق مثل هذه الشدة على لوحة μW هو 500 / سم ^{2 4.} إزالة الغطاء الألومنيوم والغطاء ، وتغطي وفضح لوحة تحتوي على الديدان TMP المعالجة لأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة لمدة 50 ثانية.
7. تغطية وترك الديدان في الظلام لمدة 5 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
8. اختيار ونقل سليم يبحث J4 اليرقات لوحات المصنف الطازجة. تجاهل المبادئ التوجيهية التالية لوحة أصلية مؤسستكم الكيميائية الخطرة.
9. باستخدام stereomicroscope ، شاشة الظواهر جيل F2 للطفرة من الاهتمام.

الجزء 7 : النتائج الممثل

بعض P. وترد الظواهر pacificus متحولة الناتجة عن الطفرات (إما عن طريق البريد الممتاز أو TMP / الأشعة فوق البنفسجية) في الشكل رقم 1. كل طافرة له النمط الظاهري هو السمة التي يمكن تمييزها بسهولة من نوع الحيوانات البرية. من الديدانالتي تم تناولها مع المغير ، 30 J3/J4 اليرقات من جيل الآباء (P0) تم وضعها في لوحات منفصلة ، وسمح لوضع البيض ، والتي هي جيل F1. من لوحات والتي أظهرت ذرية F1 صحية ، تم نقل ما مجموعه 1000 F1s على لوحات فردية وفرزهم على سلالة F2 عن الظواهر. تم العثور على الحيوانات مع بدين وقصير ^5،6 و ⁶ غير المنسقة والظواهر محول ^7.

الشكل 1. Pristionchus pacificus نوع البرية والحيوانات الطافرة. ألف باء بالوزن بالوزن خنثى ذكر جيم دال dpy متحولة UNC متحولة E. الهيئة متحولة. أعلى فريقين تبين البرية خنثى نوع (يسار) والذكور الحيوانات (يمين) مقارنة مع طفرات مختلفة في لوحات المتبقية.

Discussion

الطفرات هي تقنية تستخدم على نطاق واسع للدراسات الجينية في مختلف الكائنات النموذج التجريبي. وغالبا ما تستخدم لتحديد الطفرات التجارب وظيفة الجين ^2. ويمكن استخدام الإجراءات الطفرات وصفها هنا ليس فقط لP. pacificus ، ولكن أيضا لجيم ايليجانس الخيطية وغيرها من الأنواع ذات الصلة. نحن هنا تصف طريقتين ، EMS والطفرات TMP / الأشعة فوق البنفسجية.

EMS هو مادة كيميائية الذي يسبب طفرات أو الحذف نقطة صغيرة في جميع أنحاء الجينوم ^3،8. سورالين الطفرات (TMP / الأشعة فوق البنفسجية) يدفع معظمها الطفرات في الحمض النووي الحذف بسبب الكسر الممكنة الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية. شظايا الحذف وعادة ما تكون في حدود 0،10 حتي 15 كيلو بايت في طول ^3.

نحن لفحص الظواهر التي هي شائعة نسبيا في العثور عليها. في الشاشة باستخدام نظم الإدارة البيئية ، لوحات لكل 400 F2 مع الحيوانات ، وكان ما يقرب من صحن Dpy ، UNC أو ترا. ويمكن التعرف على حجم Dpy بواسطة أقصر ^{7 منه} ، UNC لحركته غير طبيعية ⁽⁶⁾ وترا لحصوله على النمط الظاهري الذكور والنمط النووي XX ^7. TMP / الأشعة فوق البنفسجية الطفرات لديه أدنى تردد لتوليد المسوخ مقارنة EMS ³ ، لكنه يولد أكبر الحذف.

عن الديدان الخيطية ، في وقت متأخر اليرقة المرحلة الرابعة أو الشباب البالغين هي المرحلة الأكثر فعالية الإنمائية لتنفيذ الطفرات لأن لديهم الحد الأقصى لعدد النوى خط الجرثومية. ولذلك فمن المفيد أن تبدأ التجربة مع سكان الأبوية متزامنة مع العديد من اليرقات المرحلة الرابعة. وهناك طريقة بسيطة لصنع الثقافات غير متزامنة من خلال جعل ثقافات جديدة مع البيض بدلا من الديدان البالغة. في الجيل التالي ، وسوف يكون معظم الديدان عن نفس الفئة العمرية. ويمكن الكشف عن الطفرات المتنحية عن طريق التفتيش على سلالة من الأفراد F1 ، والتي سوف تنتج حوالي خمسة وعشرون بالمائة من متماثل.

ويمكن السلطة من الشاشات الجينية في استغلال مزيد من الديدان الخيطية من خلال تعديل تصميم الشاشة ^9. مزيج من نمط الحياة السريعة وhermaphroditic الوقت جيل يجعل الديدان الخيطية مثالية لدراسات علم الوراثة.