Een inleiding tot Worm Lab: van kweken van Worms naar Mutagenesis

Summary

Screening voor mutanten met fenotypische afwijkingen is een eenvoudige methode voor het identificeren van genen die functie in een bepaald biologisch proces. In dit artikel beschrijven we hoe u de cultuur vrij levende wormen (bv.

Abstract

Dit protocol beschrijft procedures voor het onderhouden nematoden in het laboratorium en hoe je ze mutagenize met behulp van twee alternatieve methoden: ethylmethaansulfonaat (EMS) en 4, 5 ', 8-trimethylpsoralen in combinatie met ultraviolet licht (TMP / UV). Nematoden zijn krachtige biologische systemen voor genetische studies omwille van hun eenvoudige bouwplan en de paring systeem, dat bestaat uit zelf-bemesting hermafrodieten en mannetjes die kan genereren honderden nakomelingen per dier. Nematoden worden onderhouden in agar platen met een gazon van bacteriën en kan gemakkelijk worden overgedragen van de ene plaat naar de andere met behulp van een pick. EMS is een alkylerend middel vaak gebruikt om puntmutaties en kleine deleties veroorzaken, terwijl de TMP / UV voornamelijk veroorzaakt verwijderingen. Afhankelijk van de soort nematode wordt gebruikt, zal de concentratie van EMS en TMP moeten worden geoptimaliseerd. Te isoleren recessieve mutaties van de nematode Pristionchus pacificus, werden de dieren van de F2-generatie visueel gescreend fenotypes. Ter illustratie van deze methoden, we gemutageniseerd wormen en zocht naar Ongecoördineerde (UNC), Dumpy (dpy) en de transformator (Tra) mutanten.

Protocol

Deel 1: Voorbereiding van nematoden groei media (NGM) Petri platen

Experimentele nematoden, zoals C. elegans en P. pacificus worden meestal gekweekt in het laboratorium op 6 cm Petri platen met Nematode groeimedium (NGM) ^1. Wormen zijn bewaard bij 20 ° C, maar kan worden geïncubeerd bij een bereik van temperaturen (tussen 4 ° C - 25 ° C), afhankelijk van de nematode soort en de experimentele opzet. Voor te bereiden platen met NGM, standaard steriele technieken worden gebruikt om schimmel en bacteriële besmetting te voorkomen. Hieronder ziet u het protocol voor NGM platen voor te bereiden:

1. Weeg 15 g agar, 2,4 g NaCl, 2 g Trypton, en 2,72 g KH ₂ PO ₄ in 2 L erlenmeyer, maken het volume tot 1 L met water, autoclaaf en laat het afkoelen tot 60 ° C in een waterbad.
2. Voeg 0,8 ml van elk van 1 M CaCl _2, cholesterol (5 mg / ml in ethanol) en een M MgSO _4. Om te voorkomen dat schimmel-en bacteriële besmetting, 1 ml streptomycine (100 mg / ml) en 1 ml nystatine (10 mg / ml) kunnen worden toegevoegd aan elke liter medium.
3. Met behulp van een Unispense machine en handhaven van de steriele omstandigheden, giet de media in de gewenste platen. De platen moeten worden gevuld tot ongeveer 2 / 3 ^rd vol. Een standaard 60 mm diameter plaat duurt ongeveer 10 ml van de media. Niet bewegen de platen totdat de agar volledig is gelified, anders zal er een oneffen oppervlak van de agar worden, waardoor het moeilijk is om wormen richten zich op de stereomicroscoop.
4. Eenmaal gedroogd, kan de platen onmiddellijk worden gezaaid of opgeslagen bij 4 ° C tot inzaaien met bacteriën.

Deel 2: Voorbereiding OP50 bacteriën en zaaien NGM Petri platen

P. pacificus wordt gekweekt in het laboratorium door zich te voeden op de E.coli OP50 stam. OP50 heeft een beperkte groei op de NGM borden, waardoor een dun gazon dat de visualisatie van de wormen ^een vergemakkelijkt. Om te groeien van een cultuur van OP50, gebruik LB-bouillon:

1. Voeg 5 g bactotryptone, 2,5 g gistextract en 2,5 g NaCl aan een 500 ml schroefdop fles, vul aan tot 500 ml met gedestilleerd water en autoclaaf.
2. Inoculeren de bouillon met een kolonie van OP50 uit de cultuur plaat onder steriele omstandigheden en laten het 's nachts groeien bij 37 ° C.
3. LB-OP50 is klaar om gebruikt te worden en kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden als steriliteit wordt gehandhaafd. Wanneer platen moeten worden gezaaid, giet een kleine hoeveelheid van de bouillon in een kleine steriele beker en dit zal helpen voorkomen dat vervuiling van de voorraad cultuur.
4. Om zaad platen, afzien van 100 tot 120 ul van de OP50 op de 60 mm diameter NGM Petri plaat en draai om het te verspreiden.
5. Incubeer deze gezaaide plaatjes gedurende een nacht bij kamertemperatuur het gazon om te groeien. Deze geplaatste platen kunnen nu worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 3 weken. Ze op te slaan in een omgekeerde positie helpt voorkomen dat een snelle droging.

Deel 3: Het maken van een pick

In deze paragraaf beschrijven we hoe je een keuze voor de wormen te maken. De pick wordt gebruikt om wormen overbrengen van de ene locatie naar de andere. De keuze is gemaakt van 30 gauge 90% platina 10% iridium, hoewel sommige onderzoekers misschien liever iets anders metal composities:

1. Snij ongeveer 3-4 cm van de draad, plaats 0,5 cm van het binnen de top van een Pasteur pipet (waarvan tip was gebroken om een ​​kleinere lengte), en dan sluit deze in het glas boven een bunsenbrander. De lengte van de draad uitsteken van het glas is ongeveer 3 tot 3,5 cm, maar kan variëren afhankelijk van individuele voorkeuren.
2. Platter het eind van de draad die uitsteekt met een hamer of een tang. Buig het afgeplatte gedeelte omhoog om een ​​scoop te vormen.
3. Glad de scherpe randen van de te halen bij een schuurpapier om te voorkomen dat beschadiging van de worm of de agar.

Deel 4: Picking wormen

1. Om wormen halen, steriliseren de platina-draad op een vlam en sleep de afgeplatte top van de pick langs de bacteriële gazon aan de vacht van de tip met dikke kleverige bacteriën, zorg ervoor dat u doorboren of schade aan de agar oppervlak.
2. Met behulp van de stereomicroscoop, zeer licht brush de sticky tip tegen de worm / wormen om geplukt te worden tot de worm stokken op de bacteriën op de pick.
3. Zodra de worm is op de punt van het plukken, onmiddellijk overdragen aan de nieuwe plaat door het aanraken of schuifdeuren de punt van de pick tegen de bacteriële gazon van de nieuwe plaat, en de worm moeten kruipen uit. Zorg moet worden genomen niet aan de oppervlakte van agar op de plaat schade anders de wormen kruipen in de gaten waardoor het moeilijk is om ze te halen. Als de worm blijft op de pick te lang, kan het uitdrogen.

Deel 5: EMS mutagenese

Ethylmethaansulfonaat (EMS) induceert een breed spectrum van mutaties in het in het genoom 2. Mutanten kunnen worden geïdentificeerd door gebreken, zoals eieren leggen, spier-defects, geslachtsbepaling, Dauer vorming, gedrag en gonade vorming. Het protocol voor EMS mutagenese is gelijk aan die beschreven voor C. elegans ^1.

1. Bereid 500 ml (of meer) van 1N NaOH.
2. Neem 4-5, 6 cm diameter Petri platen vol met wormen, die een paar honderd wormen bij het derde larvale juveniele (J3) podium en was de wormen uit met 2-3 ml van de steriele M9 per plaat.
3. Verzamel alle wormen in een steriele, disposable 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5-7 minuten of totdat de wormen vormen een pellet.
4. Aspireren van de vloeistof en gebruik 2 ml M9 om opnieuw te schorsen van de wormen. Voeg 20 ul EMS naar een buisje met 2 ml M9 en schud om het te ontbinden. Voeg vervolgens deze EMS oplossing voor de 2 ml van de worm schorsing en zacht zwenken. De uiteindelijke concentratie van EMS zal 47 mm zijn. Let op: EMS is een zeer sterk mutageen en moet behandeld in een zuurkast te worden. Alle materialen (handschoenen, pipetten, tips), die in contact komen met deze mutageen moeten worden behandeld met 1 N NaOH op inactief de EMS. Draag dubbele handschoenen tijdens de gehele EMS mutagenese procedure. Gooi de gevaarlijke afvalstoffen op basis van uw instelling richtlijnen.
5. Plaats de centrifugebuis en bedek de dop met parafilm, horizontaal plaats deze in de zuurkast en laat de wormen incubeer gedurende 3,5 uur. De buis kan ook worden geplaatst op een lage snelheid rocker.
6. Draai de buis en dekking van de kap met parafilm; plaats in verticale positie en incubeer totdat de wormen gootsteen.
7. Zuig het supernatant af en gooi dit in een beker / kolf met 1N NaOH. Dit zal inactiveren van de EMS.
8. Voeg 5 ml M9 naar de wormen, Keer de buis 25-30 keer naar de wormen, centrifuge was bij 1500 xg gedurende 5-7 minuten of totdat de wormen vormen een pellet. Zuig het supernatant af en gooi in de 1N NaOH beker.
9. Herhaal de wasstap minstens 3 keer.
10. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de worm pellet in minimale hoeveelheid (~ 500 pi) van de M9 en pipet ze uit op NGM platen met een gazon van OP50 bacteriën. Op dit moment hoeft u niet langer aan het werk in de chemische kap.
11. Laat de vloeistof drogen voor een paar minuten en dan oppakken en overdragen gezond uitziende J4 larven in de frisse gezaaid platen. Gooi de originele plaat op basis van uw instelling gevaarlijk afval richtlijnen.
12. Laat de gemutageniseerde wormen zelf te bevruchten. Met behulp van een stereomicroscoop, het scherm van de F2-generatie fenotypes voor de recessieve mutanten van belang.

Deel 6: Psoralen mutagenese

In deze paragraaf beschrijven we de procedure voor het mutagenese met behulp van TMP in combinatie met lange golflengte ultraviolet (UV). TMP / UV methode van mutagenese wordt veel gebruikt om deletiemutaties veroorzaken binnen een genoom ^3.

1. Verzamel wormen uit 4-5, 6 cm diameter Petri platen in een 15 ml centrifugebuis, zoals beschreven in de vorige procedure.
2. Voeg 10 ml M9, omkeren 20 keer om de wormen, en centrifugeer wassen bij 1500 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en herhaal het wassen voor een totaal van 3 keer. Aspireren de vloeistof en de wormen weer te schorten in ongeveer 10 maal het volume van de M9 met 30 ug / ml van TMP. Pipetteer 20 ul van TMP (3 mg / ml) in 2 ml van de M9. Net als EMS, TMP is een krachtige kankerverwekkende stof en moeten worden behandeld met de juiste veiligheidsmaatregelen. Om te voorkomen dat mogelijke risico's van het UV-licht juiste oog draagt ​​moet worden gebruikt. De disposables moet worden weggegooid in de juiste biohazard zakken.
3. Incubeer het buisje in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een lage snelheid rocker (40 UPM). Verticaal stellen het overdekte buis gedurende 10 minuten om alle wormen laten zinken.
4. Verwijderen de wormen uit de bodem van de buis met een Pasteur pipet en breng ze naar een ongeplaatste NGM plaat. Verwijder het supernatant volgende gevaarlijke uw instelling de chemische richtlijnen.
5. Hou de plaat in het donker totdat de overmaat TMP wordt geabsorbeerd in de plaat.
6. Met behulp van een UV-intensiteit meter, de afstand tussen de lange golf UV-bron en de plaat zodanig dat de intensiteit op de plaat is 500 μW / cm ^{2 4.} Verwijder het aluminium deksel en het deksel en de deksel en bloot de plaat met de TMP behandeld wormen aan de lange golf UV-straling voor 50 seconden.
7. Deksel en laat de wormen in het donker gedurende 5 uur bij kamertemperatuur.
8. Pick en overdracht gezond uitziende J4 larven in de frisse gezaaid platen. Gooi de originele plaat volgende gevaarlijke uw instelling de chemische richtlijnen.
9. Met behulp van een stereomicroscoop, het scherm van de F2-generatie fenotypes voor de mutatie van belang.

Deel 7: representatieve resultaten

Een deel van de P. pacificus mutant fenotypes als gevolg van de mutagenese (hetzij door EMS of TMP / UV) zijn weergegeven in figuur 1. Elke mutant heeft een karakteristieke fenotype dat is gemakkelijk te onderscheiden van de wilde soort dier. Van de wormendie werden behandeld met de mutageen, 30 J3/J4 larven uit de ouderlijke generatie (P0) werden geplaatst in afzonderlijke platen en liet voor eieren, die de F1-generatie te leggen. Van de platen die een gezonde F1 nakomelingen toonden, werden in totaal 1000 F1's overgebracht naar de individuele borden en de F2 nakomelingen werden gescreend op fenotypes. Dieren met Dumpy ^5,6, Ongecoördineerde ⁶ en ⁷ Transformator fenotypen gevonden.

Figuur 1. Pristionchus pacificus wild-type en mutant dieren. A. wt hermafrodiet B. gew mannelijk C. dpy mutant D. unc mutant E. tra mutant. Bovenste twee panelen met wild-type hermafrodiet (links) en mannelijke (rechts) dieren te vergelijken met de verschillende mutanten in de resterende panelen.

Discussion

Mutagenese is een grote schaal wordt toegepast techniek voor genetische studies in verschillende experimentele model organismen. Mutagenese experimenten worden vaak gebruikt om de functie van een gen ^twee te identificeren. De mutagenese hier beschreven procedures kan worden gebruikt, niet alleen voor P. pacificus, maar ook voor C. elegans en andere verwante soorten aaltjes. Hier beschrijven we twee methodes, EMS en TMP / UV mutagenese.

EMS is een chemische stof die puntmutaties of kleine deleties het hele genoom van ^3,8 induceert. Psoralen mutagenese (TMP / UV) induceert meestal deletiemutaties in het DNA als gevolg van mogelijke breuk veroorzaakt door de UV-licht. De verwijdering fragmenten zijn meestal in het bereik van 0,10 tot 15 kb in lengte ^3.

We gescreend op fenotypen die komen relatief vaak voor te vinden. In een scherm met behulp van EMS, voor elk 400 platen met F2 dieren, over een plaat had een dpy, Unc of Tra. Dpy is te herkennen aan de kortere maat ^7, Unc voor zijn abnormale beweging ⁶ en Tra voor het hebben van een mannelijke fenotype en een XX karyotype ^7. TMP / UV mutagenese heeft een lagere frequentie van het genereren van mutanten ten opzichte van EMS ^3, maar het genereert groter verwijderingen.

Voor nematoden, het einde van de vierde etappe larve of jong volwassene is de meest effectieve ontwikkelingsstadium uit te voeren mutagenese omdat ze het maximum aantal kiemlijn kernen. Daarom is het nuttig om te beginnen met het experiment met een gesynchroniseerde ouderlijk populatie met vele vierde stadium larven. Een eenvoudige manier van het maken van gesynchroniseerde culturen is door het maken van nieuwe culturen met eieren in plaats van volwassen wormen. In de volgende generatie, zullen de meeste wormen zijn ongeveer dezelfde leeftijd. Recessieve mutaties kunnen worden gedetecteerd door het inspecteren van de nakomelingen van de F1-individuen, die zal produceren ongeveer vijfentwintig procent van de homozygote.

De kracht van genetische screens in nematoden kan verder worden benut door aanpassing van de vormgeving van het scherm ^9. De combinatie van hermafrodiete levensstijl en de snelle generatie tijd maakt nematoden ideaal voor genetische studies.