Введение в Worm Лабораторная работа: от культивирования червей для мутагенеза

Summary

Скрининг на мутантов с фенотипическими дефектов простой метод для выявления генов, которые функционируют в данный биологический процесс. В этой статье мы опишем, как культура свободного червей жизни (например,

Abstract

Этот протокол описывает процедуры для поддержания нематод в лаборатории и, как mutagenize их с помощью двух альтернативных способов: этиловый сульфонат метана (EMS) и 4, 5, 8-trimethylpsoralen в сочетании с ультрафиолетовым светом (TMP / UV). Нематоды являются мощными биологическими системами для ДНК-исследований из-за их простой план тела и система скрещивания, в состав которого входят самооплодотворяющимися гермафродиты и мужчин, которые могут генерировать сотни потомства на одно животное. Нематоды ведутся в агара чашки, содержащие газон бактерий и могут быть легко перенесены из одной пластины к другой, используя выбор. EMS является алкилирующего агента обычно используется, чтобы вызвать точечные мутации и малых удалений, в то время как TMP / UV основном вызывает удалений. В зависимости от вида нематод используются, концентрации EMS и TMP должны быть оптимизированы. Чтобы изолировать рецессивных мутаций расШсиз нематоды Pristionchus, животные F2 поколения были визуально обследование на фенотипы. Для иллюстрации этих методов мы мутагенизированных червей и искали Несогласованные (UNC), унылый (DPY) и трансформатор (TRA) мутантов.

Protocol

Часть 1: Подготовка нематоды питательной среды (НГО) чашки Петри

Экспериментальные нематод, таких как С. Элеганс и П. расШсиз, как правило, культивируют в лаборатории на 6 см чашках Петри содержащие нематода Рост средний (НГО) ^1. Черви хранятся при температуре 20 ° C, но может быть инкубировали при диапазоне температур (от 4 ° C - 25 ° С), в зависимости от видов нематод и экспериментального проектирования. Для подготовки пластин с НГО, стандартные стерильные методы должны быть использованы, чтобы предотвратить грибковые и бактериальные загрязнения. Ниже приводится протокол для подготовки NGM плит:

1. Взвесьте 15 г агара, 2,4 г NaCl, 2 г триптон, и 2,72 г KH ₂ PO ₄ в 2 л коническую колбу, чтобы объем до 1 л воды, автоклав и дайте ему остыть до 60 ° С на водяной бане.
2. Добавить 0,8 мл 1 М CaCl _2, холестерина (5 мг / мл в этаноле), и 1 М MgSO _4. Для профилактики грибковых и бактериальных загрязнений, 1 мл стрептомицина (100 мг / мл) и 1 мл нистатина (10 мг / мл) могут быть добавлены в каждый литр среды.
3. Использование Unispense машины и поддержания стерильных условиях, залить средств массовой информации в нужное пластин. Плиты должны быть заполнен на 2 / ^3-й полном объеме. Стандартным диаметром 60 мм пластины требуется около 10 мл СМИ. Не перемещайте пластин до агар полностью gelified, в противном случае будет неровной поверхности агара, что делает ее трудно сосредоточиться червей на стереомикроскопа.
4. После высыхания плиты могут быть посеяны сразу или хранить при температуре 4 ° С до посева с бактериями.

Часть 2: Подготовка OP50 бактерий и посева NGM чашки Петри

П. расШсиз выращиваются в лабораторных условиях, питаясь штамма E.coli OP50. OP50 имеет ограниченный рост на NGM пластины, тем самым образуя тонкую газон, который облегчает визуализацию червей ^1. Чтобы вырастить культуру OP50, используйте LB-бульон:

1. Добавить 5 г bactotryptone, 2,5 г дрожжевого экстракта и 2,5 г NaCl в 500 мл флакон крышкой, составляют объем до 500 мл дистиллированной воды и автоклав.
2. Привить бульон с одной колонии OP50 от культуры пластины в стерильных условиях, и пусть она растет в течение ночи при температуре 37 ° C.
3. LB-OP50 готова для использования и может храниться при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев, если стерильность сохраняется. Всякий раз, когда пластины должны быть посеяны, залить небольшим количеством бульона в небольшую стерильную мензурку, и это поможет предотвратить загрязнение фондовом культуры.
4. Для семян плиты, отказаться от 100-120 мкл OP50 на 60 мм в диаметре NGM Петри пластине и вихревые распространять его.
5. Инкубируйте эти посеяны пластин в течение ночи при комнатной температуре в течение газон расти. Эти отобранные пластин теперь можно хранить при температуре 4 ° С в течение 3 недель. Хранение их в перевернутом положении помогает предотвратить быстрое высыхание.

Часть 3: Создание выбрать

В этом разделе мы опишем, как сделать выбор для червей. Выбрать используется для передачи червей из одного места в другое. Выбрать состоит из 30 калибр 90% платины 10% иридия проволоки, хотя некоторые исследователи предпочитают несколько различных композиций из металла:

1. Отрежьте около 3-4 см провода, место 0,5 см внутрь кончиком пипетки Пастера (вершина которого была нарушена в меньшей длины), а затем запечатать его в стекло над горелкой Бунзена. Длина провода торчащие из стекла составляет около 3-3,5 см, но может меняться в зависимости от индивидуальных предпочтений.
2. Свести конце провода, выступающие с помощью молотка или плоскогубцами. Затем согните вверх уплощенная часть для формирования совок.
3. Сглаживание острых краев забрать с наждачной бумагой, чтобы предотвратить повреждение червя или агар.

Часть 4: Выбор червей

1. Чтобы выбрать червей, стерилизовать платиновой проволоки на пламени и перетащите плоский кончик подобрать по бактериальным газоном, чтобы покрыть наконечник с толстым липким бактерий, заботясь, чтобы не прокола или повреждения поверхности агара.
2. Использование стереомикроскопа, очень легко чистить липкий кончик против червя / червей, чтобы ее взяли, пока червь палочки на бактерии на выбор.
3. Как только червь на кончике забрать, передать его непосредственно к новой пластинкой, касаясь или раздвижные кончик поднять против бактериального газона новой пластинки, и червь должны расползаться. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить поверхность агара на тарелке еще червей ползать в отверстия, что затрудняет для их извлечения. Если червь остается на выбор слишком долго, он может высыхать.

Часть 5: EMS мутагенеза

Этиловый метан сульфонат (EMS) индуцирует широкий спектр мутаций в геноме 2. Мутанты могут быть идентифицированы как дефекты кладки, мышечные дефектыс, определение пола, Dauer образование, поведение и гонады образования. Протокол EMS мутагенеза, аналогичный описанному для C. Элеганс ^1.

1. Подготовка 500 мл (или более) 1 н NaOH.
2. Возьмите 4-5, 6 см в диаметре чашки Петри с червями, содержащих несколько сотен червей на третьей личиночной несовершеннолетних (J3) этапа и мыть червей с использованием 2-3 мл стерильного M9 на чашку.
3. Соберите все черви в стерильные, одноразовые трубки центрифуги 15 мл. Центрифуга на 1500 мкг в течение 5-7 минут или до червей форме гранул.
4. Аспирацию жидкости и использовать 2 мл M9 повторно приостанавливать червей. Добавьте 20 мкл EMS для трубки, содержащей 2 мл M9 и потрясите, чтобы растворить его. Затем добавить это решение EMS к 2 мл суспензии червя и водоворот мягко. Конечная концентрация EMS будет 47 мм. Внимание: EMS является очень сильным мутагенным и должны быть обработаны в вытяжном шкафу. Все материалы (перчатки, пипетки, советы), которые вступают в контакт с этой мутаген следует относиться с 1N NaOH до неактивных EMS. Одежда двойных перчаток во время всей процедуры мутагенеза EMS. Утилизация опасных отходов в соответствии с руководящими принципами вашей организации.
5. Место центрифужную пробирку и покрывают крышкой с парафильмом; поместите его горизонтально в вытяжной шкаф и пусть червей инкубировать в течение 3,5 часов. Трубка может быть размещен на низкой скорости рокер.
6. Включите трубки и покрывают крышкой с парафильмом; место в вертикальное положение и инкубировать до раковины червей.
7. Аспирируйте супернатант и выбросить его в стакан / колбу 1N NaOH. Это инактивирует EMS.
8. Добавьте 5 мл M9 для червей, инвертировать трубки 25-30 раз мыть червей, центрифуге при 1500 мкг в течение 5-7 минут или пока черви форме гранул. Аспирируйте супернатант и выбросить в 1N NaOH стакан.
9. Повторите промывание шаг по крайней мере 3 раза.
10. После последней промывки, вновь приостановить червь осадок в минимальном количестве (~ 500 мкл) M9 и пипетки их на NGM чашки, содержащие газон OP50 бактерий. В этот момент вам больше не нужно работать в химической капотом.
11. Пусть жидкость высохнуть в течение нескольких минут, а затем выбрать и передачи здоровый J4 личинок на свежий пластинами заполнена. Откажитесь от оригинальной пластины в соответствии с руководящими принципами опасных вашей организации отходов.
12. Позвольте себе мутагенизированных червей оплодотворению. Использование стереомикроскопа, экран F2 фенотипы поколения для рецессивных мутантов интересов.

Часть 6: Psoralen мутагенеза

В этом разделе мы опишем процедуру использования мутагенеза TMP в сочетании с длинной волны ультрафиолетового (УФ). TMP / УФ методом мутагенеза широко используется, чтобы вызвать исключение мутаций в геноме ^3.

1. Сбор червей от 4-5, 6 см в диаметре чашках Петри в 15 мл центрифужную пробирку, как описано в предыдущей процедуре.
2. Добавьте 10 мл M9, инвертировать 20 раз мыть червей и центрифуге при 1500 мкг в течение 5 минут. Удалите супернатант и повторите мытье в общей сложности 3 раза. Аспирацию жидкости и вновь приостановить червей примерно в 10 раз больше объема M9, содержащей 30 мкг / мл TMP. Внесите 20 мкл TMP (3 мг / мл) в 2 мл M9. Как EMS, TMP является канцерогеном и должна обрабатываться принятия надлежащих мер безопасности. Для предотвращения потенциального риска ультрафиолет надлежащего глаз носит должен быть использован. Одноразовых должны быть уничтожены в надлежащем биологической сумки.
3. Инкубируйте пробирку в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре на низкой скорости рокер (40 ОНД). Установить покрыта труба вертикально в течение 10 минут, чтобы все черви раковину.
4. Удалить червей из нижней части трубки с пипетки Пастера и передачи их на unseeded пластины NGM. Удалите надосадочную следующих опасных принципов вашей организации химических веществ.
5. Храните пластины в темноте, пока избыток TMP всасывается в тарелку.
6. Использование УФ-метр интенсивности, установить расстояние между длинными источника УФ-волны и пластинка так, что интенсивность на пластину составляет 500 мкВт / см ^{2 4.} Снимите крышку алюминия и крышки и крышки и разоблачить пластины, содержащей TMP лечение червей долго УФ излучение в течение 50 секунд.
7. Накрыть и оставить червей в темноте в течение 5 часов при комнатной температуре.
8. Комплектование и передача здоровый J4 личинок на свежий пластинами заполнена. Откажитесь от оригинальной пластины следующих опасных принципов вашей организации химических веществ.
9. Использование стереомикроскопа, экран F2 фенотипы поколения для мутации интерес.

Часть 7: Представитель Результаты

Некоторые из P. расШсиз мутант фенотипы в результате мутагенеза (либо EMS или TMP / UV), показаны на рисунке 1. Каждый мутант имеет характерный фенотип, который легко отличимы от дикого животного типа. От червей, которые лечили мутаген, 30 J3/J4 личинок из родительского поколения (P0) были помещены в отдельные тарелки и позволили, чтобы отложить яйца, которые поколения F1. Из пластин, которые показали, здорового потомства F1, в общей сложности 1000 F1s были переведены на отдельные тарелки и F2 потомства был показан на фенотипы. Животные с унылый ^5,6, Нескоординированные ⁶ и ⁷ Трансформатор фенотипы были найдены.

Рисунок 1. Pristionchus расШсиз дикого типа и мутантных животных. А. Б. вес гермафродит вес мужчин С. Д. DPY мутант UNC-мутанта E. тра мутанта. Top две панели показывает дикого типа гермафродит (слева) и самца (справа) животных для сравнения с различными мутантами в остальных панелей.

Discussion

Мутагенеза является широко применяется методика генетических исследований в различных экспериментальных модельных организмов. Мутагенез эксперименты часто используется для определения функций генов ^2. Мутагенеза процедур, описанных здесь, может использоваться не только для P. расШсиз, но и для С. Элеганс и других связанных с ними видов нематод. Здесь мы опишем два метода, EMS и TMP / УФ-мутагенеза.

EMS является химическое вещество, которое вызывает точечные мутации или делеции небольших по всему геному ^3,8. Psoralen мутагенеза (TMP / UV), в основном вызывает исключение мутаций в ДНК, из-за возможной поломки индуцированного УФ-светом. Удаление фрагментов, как правило, в диапазоне от 0,10 до 15 кб в длину ^3.

Мы обследование на фенотипы, которые относительно часто, чтобы найти. В экране с помощью EMS, для каждого 400 пластин с F2 животных, около одной пластины были DPY, Unc или Тра. DPY можно узнать по коротким размером ^7, Unc за ненормальное движение ⁶ и Тра за то, что мужской фенотип и кариотип ХХ ^7. TMP / УФ-мутагенеза имеет более низкую частоту генерации мутантов по сравнению с EMS ^3, но она порождает больше удалений.

Для нематод, личинки конце четвертого этапа или молодому человеку это наиболее эффективный этап развития для проведения мутагенеза, потому что они имеют максимальное количество зародышевых ядер линии. Поэтому полезно начать экспериментировать с синхронизированной родительского населения со многими четвёртый личинки стадии. Простой способ создания синхронизированных культур, делая новые культуры с яйцами, а не взрослых червей. В следующем поколении, большинство червей будет примерно того же возраста. Рецессивных мутаций могут быть обнаружены путем проверки потомства F1 лиц, которые будут производить около двадцати пяти процентов от гомозиготной.

Мощность генетических экраны у нематод можно дополнительно использовать, изменив дизайн экрана ^9. Сочетание гермафродиты образ жизни и быстрое время генерации составляет нематод идеально подходит для ДНК-исследований.