Omvänd genetiska metoder har visat sig extremt användbart för att avgöra vilka gener som underliggande motstånd mot vektor patogener i myggor. Denna video protokoll illustrerar en metod som Dimopoulos labbet att injicera dsRNA i Anopheles gambiae myggor som hyser malariaparasiten. Tekniken manipulera injektionen setup och injicera dsRNA i bröstkorgen illustreras.
Abstract
Omvänd genetiska metoder har visat sig extremt användbart för att avgöra vilka gener som underliggande motstånd mot vektor patogener i myggor. Denna video protokoll illustrerar en metod som Dimopoulos labbet att injicera dsRNA i Anopheles gambiae myggor som hyser malariaparasiten. Tekniken manipulera injektionen setup och injicera dsRNA i bröstkorgen illustreras.
Protocol
RNAi-medierad geners uttryck i myggor kräver förberedelser och rening av specifika dsRNAs som riktar genen av intresse. För dsRNA syntes, rekommenderar vi att satsen Ambion Megascript som använder sig av en T7 RNA-polymeras-medierad in vitro transkription reaktion. För dsRNA rening rekommenderar vi Qiagen RNeasy kit. Prover på dsRNA bör kvantifieras och justeras till 3 mikrogram / mikroliter i vatten. Andra material du behöver är: spetsig pincett, glasskiva, glas microcapillary nålar, microinjector (v…
Discussion
Effektivitet av geners uttryck är mycket varierande och beror på ett antal faktorer, inklusive utskrift och protein omsättning priser, och dsRNA upptag effektivitet genom celler och organ. Vi har funnit att tysta börjar så tidigt som en injektion dagen efter och kan pågå upp till 6 dagar efter injektionen. Använd utskrift och protein detektionsmetoder såsom kvantitativa PCR och Western blotting för att validera tysta.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Megascript
kit
Ambion
for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy
Qiagen
For dsRNA purification
dsRNA
should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water