Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü Dimopoulos laboratuar tarafından dsRNA Anofel gambiae sivrisinekler, sıtma paraziti limanın içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. Enjeksiyon kurulum ve toraks içine enjekte dsRNA manipüle tekniği gösterilmiştir.
Abstract
Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü Dimopoulos laboratuar tarafından dsRNA Anofel gambiae sivrisinekler, sıtma paraziti limanın içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. Enjeksiyon kurulum ve toraks içine enjekte dsRNA manipüle tekniği gösterilmiştir.
Protocol
Sivrisinek RNAi-aracılı gen susturulması ilgi gen hedef belirli dsRNAs önceden hazırlanması ve arıtma gerektirir. DsRNA sentezi için, biz bir T7 RNA polimeraz aracılı in vitro transkripsiyon reaksiyonu kullanır Ambion Megascript kitini tavsiye ederiz . DsRNA arıtma için, biz Qiagen RNeasy kitini tavsiye ederiz. DsRNA, Örnekleri sayısal ve 3 mikrogram / mcL su ayarlanmış olmalıdır. Gereksinim duyacağınız diğer malzemeler şunlardır: ince uçlu forseps, cam Slayt, cam microcapillary iğnel…
Discussion
Gen susturma Verim çok değişkendir ve hücreler ve organlar tarafından transkript ve protein ciro oranları ve dsRNA alımı verimliliği de dahil olmak üzere bir takım faktörlere bağlıdır. Biz susturulması gibi erken 1 gün yazılan enjeksiyon başlar ve en fazla 6 gün enjeksiyonu sürebilir bulduk. Susturulması doğrulamak için blot gibi kantitatif PCR ve Batı olarak transkript ve protein algılama yöntemleri kullanın.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Megascript
kit
Ambion
for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy
Qiagen
For dsRNA purification
dsRNA
should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water