במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

Summary

המודל של העכבר

Abstract

השתלת בתאי גזע ווירוסים ברחם יש פוטנציאל עצום בטיפול בהפרעות מולדים בעובר אנושי. לדוגמה, השתלה ברחם (IUT) של בתאי גזע hematopoietic שימש בהצלחה לטיפול בחולים עם כשל חיסוני חמור ^1,2. משולב בתנאים אחרים, לעומת זאת, IUT כבר ניסו ללא הצלחה. ³ בהתחשב אלה תוצאות מעורבות, בזמינות מודל לא אנושיים יעיל ללמוד את sequelae הביולוגי של השתלת תא גזע ו ריפוי גנטי הוא קריטי כדי לקדם את התחום. אנו ואחרים השתמשו במודל עכבר של IUT ללמוד הגורמים המשפיעים engraftment מוצלח של ברחם התאים המושתלים גזע hematopoietic הן wild-type ^4-7 עכברים ואנשים עם מחלות גנטיות. ^8,9 סביבת העובר גם מציע יתרונות ניכרים עבור ההצלחה של בריפוי גנטי ברחם. לדוגמה, משלוח של ¹⁰ adenoviral, adeno הקשורים נגיפית ^10, retroviral ^{11, 12,13} ו וקטורים lentiviral לתוך העובר הביא התמרה של איברים מרובים רחוקים הזריקה במבט לטווח ארוך גן. ברחם ריפוי גנטי ולכן עשוי להיחשב כאסטרטגיה טיפול אפשרי להפרעות גן יחיד, כגון ניוון שרירים או סיסטיק פיברוזיס. יתרון נוסף של IUT פוטנציאל הוא היכולת לגרום סובלנות החיסון אנטיגן ספציפי. כפי שראינו אצל עכברים עם המופיליה, את ההקדמה של פקטור IX מוקדם בתוצאות פיתוח סובלנות חלבון זה. ¹⁴

בנוסף השימוש בו בחקירת טיפולים פוטנציאל אנושי, המודל של העכבר IUT יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור שאלות בסיסיות בביולוגיה של התא התפתחותיים גזע. לדוגמה, ניתן להעביר מולקולות קטנות שונות כדי לעורר או לעכב ביטוי גנים ספציפיים בשלבים הריונית מוגדרת ולטפל מסלולים התפתחותיים. ההשפעה של שינויים אלה ניתן להעריך את timepoints שונים לאחר ההשתלה הראשונית. יתר על כן, אפשר להשתיל pluripotent או שושלת ובתאים ספציפיים לסביבה העובר ללמוד בתאי גזע בידול בסביבה לארח לא מוקרן ו בשלוות נפש.

במודל עכבר של IUT סיפקה כבר תובנות רבות בתחומי אימונולוגיה, ביולוגיה של התא התפתחותיים גזע. בפרוטוקול וידאו מבוסס זה, אנו מתארים גישה צעד אחר צעד לביצוע IUT בעוברים העכבר מתאר את הצעדים ביקורתית בעיות פוטנציאליות של טכניקה זו.

Protocol

1. הכנת pipettes Injection

1. כייל את חולץ פיפטה כזה הפרדת פיפטה זכוכית מתרחשת תוך 15 שניות (ראו הוראות היצרן לגבי כיול). פיפטה יהיה להתחדד שבו הוא מפריד.
2. חותכים את קצה פיפטה כך את המרחק מתחילת להתחדד לסוף פיפטה הוא 1.04cm כדי 1.05cm. אורכו של פיפטה עומדת ביחס הפוך בקוטר של פתח פיפטה. שים לב כי קבלת פיפטה יותר גם התוצאות טיפ חלש כי הוא רגיש יותר שבירה במהלך ההזרקה.
3. הצעד הבא בקבלת פיפטה היא ליצור שיפוע חלקה על ידי חידוד טיפ על גלגל השחזה יהלום. בזמן חיתוך פיפטה לגודל המתאים, פיפטה הפסקות תכופות עם שפוע טבעי בקצהו אשר חייב להיות בשימוש בעת הצבת פיפטה על ההגה. במהלך תהליך זה, חשוב בעדינות שאר פיפטה על ההגה חידוד ומדי פעם להעריך מחדש כדי לוודא פיפטה עדיין לגעת בהגה (כמו שפוע הופך חלק יותר, זה יהיה לאבד קשר עם ההגה השחזה).
4. לאחר שפוע חלקה, קצה פיפטה חייב להיות מחודד (איור 1). הגבהה של פיפטה כך זה כבר לא נוגע גלגל השחזה, לסובב אותו עם כיוון השעון על 10-50 מעלות, במקום לחזור פיפטה על ההגה השחזה מסתובבת עבור ~ 10 שניות. למשוך את פיפטה מן ההגה חידוד ועכשיו לבחון את קצה. שלב זה בדרך כלל יש צורך לחזור עם כמה התאמות קטנות כדי ליצור קצה חד. אם פיפטה ממוקם בקצה שלה במשך זמן רב מדי, הוא סיכוי גבוה יותר לפתח משטח אחיד (איור 1). לאחר השלמת צד אחד, אתה יכול להמשיך לחדד את הקצה השני על ידי חזרה על השלבים שלעיל.
5. השתמש בטוש בלתי מחיק למתוח קו ההיקפי כל 4mm המוצא שבו להתחדד של פיפטה מתחיל. לצבע אלה מתאימות 5uL של נפח.

2. ברחם להשתלות

1. לאחר הכנת החומר להזרקה (תאים לדוגמא, וירוס, וכו ') אתה יכול להגדיר עבור הזריקה. אנו משתמשים microinjector מחוברים אוויר דחוס עם ההגדרות הבאות: (הגדרות לחץ: קלט 60-80 psi, למלא 40 psi, להזריק 8-12 psi, 0 psi איזון, החזק 0 psi; זמן הזרקת 100 אלפיות השנייה).
2. כדי לעקר את פיפטה הזרקה, לנקות אותו פעמיים עם EtOH 70% ואחריו פעמיים עם סטרילי 1X PBS. כאשר קצה פיפטה הוא שביר מאוד, אנחנו לא ממליצים מעוקר pipettes ההזרקה.
3. זריקות יכול להיעשות באמצעות 2.5x-3.5X loupes הגדלה או מיקרוסקופ לנתח. הכנת שטח נוהל שלך בשמיכה מחממת, תאורה, מכשירי ניתוח הצורך.
4. להרדים את העכבר בהריון (אנו מנצלים isoflurane וחמצן שיישלח באמצעות יחידת זרימה רציפה הרדמה). הנח את העכבר על כרית חימום במצב להדביק פרקדן וכל איבר עם קלטת כדי לאבטח את העכבר במקום.
5. קליפ פרווה. ואז, כפפות כירורגיות סטריליות, מכין את הבטן עם 10% povidone-יוד ואחריו אלכוהול, להזריק כגון כאבים כמו עצירות.
6. ביצוע חתך 1cm בבטן התחתונה (ההיבט נחות ביותר של החתך צריך להיות כ 1cm מעולה introitus). לחתוך את העור ואת fascia. היזהר שלא לפצוע את אברי הבטן (המעיים ושלפוחית ​​השתן) אשר מיד מתחת לשכבה דקה של fascia.
7. בעזרת צמר גפן, בעדינות למתוח את fascia ולספק את הרחם הרה להולדת דרך החתך. ספירת המספר הכולל של העוברים על ידי הראשון לזהות את השחלות ימין ועל שמאל כדי לוודא שאתה לדמיין את הרחם כולו. מניחים את הרחם בחזרה בחלל הבטן לפני שתמשיך כך עוברים נשארים חמים בעת להתכונן זריקות.
8. צייר את העוצמה המתאימה של חומר במספר העוברים אתה מתכוון להזריק. בזמן מילוי את המחט עם מדגם שלך, חשוב לשמור על קצה פיפטה טבלו להימנע aspirating מדגם לתוך צינורות microinjector. מאז הם בדרך כלל תאים בנפח קטן, אנחנו בדרך כלל למקם אותם microfuge קטן (לשעבר: 0.5mL) צינור או ישירות על פיסת Parafilm להיות מסוגל למלא את המחט בלי לשבור את קצה פיפטה.
9. בעדינות להחזיק כל העובר ולזהות את החלק של העובר בכוונתך להזריק (כבד למשל, חלל הצפק, רגל, וכו '). עם האגודל לאצבע המורה, אתה חייב לייצב את העובר בתוך חלל מי השפיר, כך שהוא אינו מסתובב בעת ביצוע ההזרקה. חשוב להחזיק את העובר מספיק חזק כדי לייצב אותו בעדינות עדיין מספיק כדי למנוע פגיעה בו.
10. בזהירות להוסיף את פיפטה דרך הרחם, amnion, עור העובר, אל איבר המטרה. אם פיפטה היא חדה, היא צריכה לעבור בקלות דרך רקמות אלו. אם קצה פיפטה הוא משעמם, אתה wi האהלה הודעה הרחם והקרומים השפיר יהיה. להזריק את נפח הרצויה לתוך העובר כל אחד. זה הכרחי כי התנועות שלך להיות יציב בתקופת ההחדרה, הזרקה, ונסיגה של פיפטה.
11. לאחר בנפח הרצוי מוזרק, למשוך את פיפטה בזהירות. אם נעשה כראוי, החומר לא אמור לדלוף החוצה מחלל הרחם מי שפיר או. אם חור גדול נוצר amnion, אשר ניתן לזהות על ידי דליפה של מי שפיר, אז הישרדות היא בסכנה. לבסוף, ללימודים שכוללות קצירת לאחר הלידה, עוברים כל חייב לקבל זריקות מושלם מבחינה טכנית, שכן אין שום דרך להבחין בעוברים הזריק uninjected לאחר הלידה.
12. אם אתה מבצע זריקות לתוך הכבד העוברי, אתה עלול מדי פעם לראות דם קצה פיפטה לאחר מסוגר, זה מאשר שאתה במצב הנכון לא אמור להשפיע על ההישרדות. אם ביצוע התוך צפקי זריקות, במטרה מעט מתחת בכבד העובר. זריקות לשריר, ייתכן עמדת העובר כדי לזהות את הירך עצם הירך לבין להזריק את השריר הכואב. לבסוף, זריקות תוך חדרי, קל לראות את התפרים העטרה לכוון את פיפטה ליעד המתאים. זריקות אלו, טפטפות בקוטר מעט גדול יותר נדרשים כדי לחדור את הגולגולת בלי לשבור את פיפטה.
13. לאחר מכן, בזהירות המקום הרחם חזרה לתוך חלל הבטן. ודא הוא אינו מעוות על עצמו או סביב אספקת הדם שלה. ספק 1mL של סטרילית 1X PBS ב חלל הצפק של האם להחליף את כל הנוזלים שאבדו במהלך ההליך. סגירת החתך עם תפר 2 שכבות קלועה 5-0 נספגים (לשעבר: Vicryl). קודם לסגור את fascia מבלי לפצוע את המעי או שלפוחית ​​השתן הבסיסית, ולאחר מכן סגור את העור.
14. בשלב זה, שלאחר הליך תרופות יכול להיות מנוהל על שיכוך כאבים. חזור כל נקבה מוזרק לכלוב יחיד משלו במקום את הכלוב על שמיכה מחממת. צג את העכבר עד שהוא זקוף. שים מצע בכלוב והמקום העכבר באזור שקט של המתקן העכבר איפה שזה לא צריך להיות מופרע (כלומר ללא ניקוי הכלוב) עד מספר ימים לאחר הלידה. צמצום כל הלחץ נוספים החיה יקטין את הסיכויים של צירים מוקדמים.
15. לאחר שהשלמת את הזריקות, נקי פיפטה שלך פעמיים עם סטרילי 1X PBS ו EtOH פעם אחת עם 70%.
16. הנקבות מוזרק יש לשים לב יומי כדי להבטיח שהם מחלים ההליך ללא קושי. החתך צריך להיות פיקוח על סימני נפיחות ודלקת, הפרדה הפצע, אחרים של זיהום. משככי כאבים לאחר הניתוח יכול להינתן לפי הצורך.

3. נציג תוצאות:

ההישרדות של עוברים מוזרק לאספקה ​​לטווח הוא הגורם המגביל העיקרי להצלחה עם טכניקה זו. בהתאם הזריקו את החומר ואת המתח של העכבר בשימוש, שיעורי ההישרדות יכול להשתנות. באופן כללי, זריקות של תאים hematopoietic לתוך wild-type עכברים ב E14 צריך להביא לפחות 50% חיים שנולדו הגורים. שיעור גבוה יותר של הישרדות אפשריים בהתאם גם את ההיבטים הטכניים של הזריקה, כמו גם את המאפיינים של עכברים להיות מוזרק.

מזעור הטראומה הממברנות הרחם מי שפיר הוא ההיבט הטכני החשוב ביותר של פרוטוקול זה. שארפ, טפטפות בקוטר קטן תגרום טראומה מינימלית הרחם במהלך ההזרקה. אנחנו לא ממליצים על שימוש במחטים זריקה רגילה כמו ברמה של טרום מפוברק מחטים גדול מדי יגרום חור גדול הרחם. זכוכית בעבודת יד pipettes הזרקת הם רק מחטים בקוטר קטן יכול להיות מנוצל עבור זריקות ב ברחם. טכניקה ניתוחית זהירה וקפדנית, כולל טיפול עדין של הרחם הרדמה קצר היא קריטית גם עבור תוצאות אופטימליות.

המאפיינים הספציפיים של העכברים הנמען כגון רקע גנטי, גיל ההריון, והגודל החול יכול להשפיע גם על הישרדות. זנים מסוימים של עכברים רגישים יותר צירים מוקדמים אובדן הריון בהתאם הרקע הגנטי שלהם. טראנסגנטי ¹⁵ חיות עם מומים או שרירים ניווניות יכול להיות בעל יכולת לקויה לספק עוברים נרתיקית לאחר שעברו פיום בטן קו האמצע. ⁸ אלה נשים בהריון עשויים לדרוש מסירה על ידי ניתוח קיסרי סעיף. מצאנו גם כי גיל ההריון בזמן הזריקה יכולה להשפיע על הכדאיות. עוברים כי הם מתחת לגיל 12 יום עובריים יש שיעור נמוך יותר של הישרדות מאשר עוברים יותר. לבסוף, מצאנו כי בגדלים אשפה גדול (> 10 עוברים) נוטים להיות בעלי שיעור גבוה יותר של מות העובר לאחר ההזרקה. שימו לב לשני ההיבטים הטכניים של הטכניקה הזו ואת המאפיינים הספציפיים של העכברים להיות מוזרק יכולים למקסם ההישרדות של עוברים מוזרק.

ve_content "> כאשר שיטות אלה מבוצעות כראוי, אפשר לצפות כי כל העוברים נחשפים לחומר המוזרק. בדומה להגדרה לאחר הלידה, לעומת זאת, ההפצה המוצלחת של תאים או נגיפים ברחם לא תמיד התוצאה engraftment תורם התא או גן ביטוי, בהתאמה. engraftment בתאי גזע, למשל, תלויה במספר גורמים כגון המינון ואת המקור של התאים המושתלים. כמו כן, ההצלחה של התמרה ויראלית היא, בין השאר, נקבע לפי סוג של וקטור ויראלי בשימוש. צריך להבין את הגורמים הרבים הישרדות השפעה הגור, engraftment הסלולר, ו transduction ויראלי כדי להשיג הצלחה עם פרוטוקול זה.

איור 1. דיאגרמה המתארת ​​נכונה חידוד של pipettes הזרקה (שלב 1.4)

Discussion

מעל 50 שנים, בילינגהם, ברנט, ו מךוואר בשימוש ברחם השתלה בעכברים כדי לגרום סובלנות החיסונית חלבונים זרים. ¹⁶ מאז, כמה וריאציות של טכניקה זו שימשו כדי לענות על שאלות באימונולוגיה וביולוגיה בתאי גזע.

פרוטוקול מפורט כאן היא אחת מהשיטות הנגיש ביותר עבור IUT. הכבד העוברי מציעה יעד דמיינו בקלות ומספקת גישה מחזור מערכתי באמצעות הפורטל וורידים הכבד. עם זאת, מספר שינויים תוארו על מנת לייעל את התזמון ואת המיקום של ההזרקה הרצוי. לדוגמה, זריקות בעוברים צעירים יותר E13.5 יכולה להיות קשה יותר, כי הרחם אינו שקוף. אם גישה זו יש צורך במחקר אירועים מוקדם בהתפתחות, אולטרסאונד מונחה זריקות עשויה לשמש יעד רקמות בפרט. ¹⁷ הדרכה אולטראסאונד שימושית גם לכוון את הזריקה לתוך איברים בפרט, כמו הלב או הריאות. זריקות תוך ורידי לווריד vitelline ^18,19 להציע את היתרון של מתן תאים ישירות למחזור הדם ועלול לאפשר אספקת כמויות גדולות יותר של תאים. ⁵ תיארנו בכוונה גישה כללית ביצוע IUT בעכברים, כך שהקורא יש הבסיס ההכרחי כדי להשיג הצלחה עם זריקות אלו יכולים להתאים שיטות אלה ליישום הספציפי הנדרש.

למרות השימוש הראשוני ללמוד סובלנות החיסונית מעל 50 שנים, יש עדיין שאלות לא פתורות חשוב עבורו IUT יהיה מאלף. היכולת לגרום סובלנות אנטיגנים זרים ספציפי על ידי הנהגת שלהם לסביבה עוברית הודגמה בעכברים. ^4,6,7 בעוד מערכת החיסון מפתחת עוברי עכבר מאוחר יותר מזו של בעלי חיים גדולים יותר עשוי להשפיע על ממצא זה, המנגנון המדויק על ידי אשר סובלנות העובר מתרחשת בעכברים יש לחקור יותר. ניסויים אלה עשויים להבהיר דרכים לשפר אינדוקציה סובלנות אצל בני אדם. גם בעכברים, גורמים כגון הזמינות של נישות hematopoietic ואת היתרון התחרותי של תאים לארח להמשיך להגביל את ההצלחה של engraftment בתאי גזע. ³ אסטרטגיות נוכחי להמשיך לחקור זו כוללים מנגנוני מניפולציה מסוימת של התגובה החיסונית מארח ואופטימיזציה של המסלול, , העיתוי במינון של משלוח בתאי גזע. IUT לעכברים הריון מוקדם מספק מודל אידיאלי שבו ללמוד בתאי גזע engraftment והבחנה.

IUT הוא כלי רב עוצמה כדי להבין סוגיות יסוד בתחומים של תא גזע וביולוגיה התפתחותית. הגדרת מנגנונים אשר להוביל סובלנות העובר לאנטיגנים הציג ברחם יהיו השלכות משמעותיות על בתחום של השתלת תא גזע. בנוסף, ההפצה המוצלחת של וקטורים ויראליים עשויה לספק טיפול בהפרעות גן יחיד. הזמינות של מספר רב של זנים עכבר מהונדס לבין מוטציה המאפשרת חקירת תפקיד גנים ספציפיים לשחק לשנות את הפנוטיפ הצפוי. במודל עכבר של IUT יהיה ללא ספק לקדם את השדות האלה ולהביא אותנו קרוב יותר למימוש הפוטנציאל המלא שלהם קליני לטיפול בחולים עם מומים מולדים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipettes	Kimble Chase	71900-100
Pipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-30
Microinjector	Narishige International	IM-300
Pipette sharpener	Sutter Instrument Co.	Model BV-10