Summary
El modelo de ratón de
Abstract
El trasplante de células madre en el útero y el virus tiene un enorme potencial para el tratamiento de alteraciones congénitas en el feto humano. Por ejemplo, en el útero de trasplante (IUT) de las células madre hematopoyéticas se ha utilizado con éxito para tratar pacientes con inmunodeficiencia combinada severa 1,2. En otras condiciones, sin embargo, IUT se ha intentado sin éxito. 3 Teniendo en cuenta estos resultados mixtos, la disponibilidad de un sistema eficiente no humanos modelo para estudiar las secuelas biológicas del trasplante de células madre y terapia génica es fundamental para avanzar en este campo. Nosotros y otros han utilizado el modelo de ratón de la UIT para estudiar los factores que afectan de éxito del injerto en el útero trasplantado células madre hematopoyéticas, tanto en ratones de tipo salvaje 4-7 y personas con enfermedades genéticas. 8,9 El ambiente fetal también ofrece ventajas para el éxito de la terapia génica in utero. Por ejemplo, la entrega de adenovirus 10, adeno-asociado viral 10, 11 antirretrovirales, y los vectores lentiviral 12,13 en el feto ha dado lugar a la transducción de múltiples órganos distantes del sitio de la inyección con la expresión genética a largo plazo. En el útero por lo tanto, la terapia génica puede ser considerada como una posible estrategia de tratamiento para los trastornos de un único gen, como la distrofia muscular o fibrosis quística. Otra ventaja potencial de IUT es la capacidad de inducir tolerancia inmunológica a un antígeno específico. Como se ha visto en ratones con hemofilia, la introducción del factor IX a principios de los resultados del desarrollo de la tolerancia a esta proteína 14.
Además de su uso en la investigación de terapias potenciales humanos, el modelo de ratón de IUT puede ser una poderosa herramienta para estudiar las cuestiones básicas de la biología celular y del desarrollo del tallo. Por ejemplo, se puede ofrecer varias moléculas pequeñas para inducir o inhibir la expresión de genes específicos en etapas definidas gestacional y manipular las vías de desarrollo. El impacto de estas alteraciones puede ser evaluado en los puntos de tiempo diferentes después del trasplante inicial. Además, se puede trasplantar células pluripotentes específicas o linaje progenitor en el medio ambiente fetal para estudiar la diferenciación de células madre en un entorno de acogida no irradiados y sin inmutarse.
El modelo de ratón de IUT ya ha proporcionado información numerosas en el campo de la inmunología, biología celular y del desarrollo y el tallo. En este protocolo basado en video, se describe un enfoque paso a paso para realizar el IUT de fetos de ratones y delinear los pasos críticos y peligros potenciales de esta técnica.
Protocol
1. Preparación de pipetas de inyección
- Calibrar el extractor de la pipeta de modo que la separación de la pipeta de vidrio se produce en 15 segundos (vea las instrucciones del fabricante con respecto a la calibración). La pipeta se tiene una forma cónica que se separa.
- Corte el extremo de la pipeta de modo que la distancia desde el inicio de la puesta a punto hasta el final de la pipeta se 1.04cm de 1.05cm. La longitud de la pipeta es inversamente proporcional a la talla del orificio de la pipeta. Tenga en cuenta que la toma de una pipeta ya también se traduce en una punta más débil que es más susceptible a la rotura durante la inyección.
- El siguiente paso en la toma de la pipeta es para crear un bisel liso de afilar la punta en una rueda de diamante afilado. En el momento de cortar la pipeta al tamaño adecuado, la pipeta a menudo se rompe con un bisel natural en su extremo que se debe utilizar cuando se coloca la pipeta en el volante. Durante este proceso, es importante para que se apoye la pipeta en la rueda de afilar y la reevaluación periódica para asegurarse de que la pipeta ha dejado de tocar la rueda (como el bisel se vuelve más suave, se pierde el contacto con la rueda de afilar).
- Una vez que el bisel es suave, la punta de la pipeta debe estar afilada (Figura 1). Elevar la pipeta de tal manera que ya no es tocar la rueda de afilar, gire hacia la derecha por 10 a 50 grados, y coloque la pipeta sobre la rueda giratoria para el afilado de 10 segundos. Retirar la pipeta de la rueda de afilar y ahora a examinar el borde. Este paso lo general tiene que ser repetido con varios pequeños ajustes para crear un borde afilado. Si la pipeta se coloca en el borde por mucho tiempo, es más probable el desarrollo de una superficie irregular (Figura 1). Después de completar un lado, se puede proceder a afilar el extremo opuesto, repitiendo los pasos anteriores.
- Use un marcador permanente para dibujar una línea circunferencial cada 4 mm de partida en el cono de la pipeta empieza. Estas demarcaciones corresponden a 5UL de volumen.
2. Trasplante en el útero
- Después de preparar el material inyectable (por ejemplo, células, virus, etc) se puede configurar para la inyección. Utilizamos un microinyector conectado a aire comprimido con la siguiente configuración: (ajustes de presión: de entrada 60-80 psi, llenar 40 psi, inyectar 8-12 psi, el balance de 0 psi, mantenga 0 psi, tiempo de inyección de 100 milisegundos).
- Para esterilizar la pipeta de inyección, se limpia dos veces con EtOH al 70% seguido por dos veces con PBS estéril 1X. Como la punta de la pipeta es muy frágil, no recomendamos el autoclave las pipetas de inyección.
- Las inyecciones se puede hacer uso de 2,5 veces, 3,5 veces las lupas de aumento o un microscopio de disección. Prepare el área de procedimiento con una manta térmica, la iluminación y los instrumentos quirúrgicos necesarios.
- Anestesiar el ratón embarazadas (que utilizan el isoflurano y el oxígeno suministrado a través de una unidad de anestesia de flujo continuo). Coloque el ratón sobre una almohadilla en la posición supina y colocar cada parte con cinta adhesiva para sujetar el ratón en su lugar.
- Clip de la piel. Entonces, el uso de guantes quirúrgicos estériles, preparación del abdomen con un 10% de povidona yodada seguido por el alcohol, y se inyecta un analgésico como la buprenorfina.
- Haga una incisión de 1 cm en la parte baja del abdomen (la parte más inferior de la incisión debe ser de aproximadamente 1 cm superior a la del introito). Incisión en la piel y la fascia. Tenga cuidado de no dañar los órganos abdominales (intestino y la vejiga), que son inmediatamente debajo de la fina capa de la fascia.
- Usar hisopos de algodón, estirar suavemente la fascia y entregar el útero grávido a través de la incisión. Cuente el número total de los fetos, en primer lugar la identificación de los ovarios a derecha e izquierda para asegurarse de que visualizar todo el útero. Lugar en el útero de nuevo en la cavidad abdominal antes de proceder a fin de que los fetos permanecer caliente mientras se prepara para las inyecciones.
- Extraiga el volumen adecuado de material para el número de fetos va a inyectar. Mientras se llena la aguja con la muestra, es importante mantener la punta de la pipeta para evitar la aspiración sumergida la muestra en el tubo microinyector. Dado que las células están generalmente en un pequeño volumen, por lo general los coloca en una microcentrífuga pequeños (por ejemplo: 0,5 ml) de tubo o directamente en un trozo de Parafilm para poder llenar la aguja sin romper la punta de la pipeta.
- Aplique suavemente cada feto e identificar la parte del feto va a inyectar (por ejemplo, hígado, la cavidad peritoneal, la pierna, etc.) Con el pulgar y el índice, se debe estabilizar el feto dentro de la cavidad amniótica para que no gire mientras está realizando la inyección. Es importante mantener el feto con la suficiente firmeza para estabilizarlo pero con cuidado suficiente para evitar que se dañe.
- Introduzca con cuidado la pipeta a través del útero, amnios y la piel del feto, y en el órgano diana. Si la pipeta es fuerte, se debe pasar fácilmente a través de estos tejidos. Si la punta de la pipeta es aburrida, que wi ll abombamiento aviso del útero y las membranas amnióticas. Inyectar el volumen deseado en cada feto. Es imprescindible que los movimientos se firme durante el tiempo de la inserción, la inyección y retiro de la pipeta.
- Una vez que el volumen deseado mediante una inyección, retirar la pipeta con cuidado. Si se realiza correctamente, el material no debe salirse de la cavidad amniótica o el útero. Si un agujero grande que se crea en el amnios, que se puede reconocer por la pérdida de líquido amniótico, la supervivencia está en peligro. Finalmente, para los estudios que involucran a la cosecha después del parto, todos los fetos deben recibir inyecciones de técnica perfecta, ya que no hay manera de discernir los fetos inyectadas y no inyectadas después del nacimiento.
- Si va a realizar inyecciones en el hígado fetal, en ocasiones puede ver sangre en la punta de la pipeta después de su retirada, lo que confirma que está en la posición correcta y no debe afectar a la supervivencia. Si se realiza intra-peritoneal inyecciones, el objetivo ligeramente por debajo del hígado fetal. Para las inyecciones intramusculares, es posible que la posición del feto para identificar la cadera y el fémur y se inyecta el músculo del glúteo. Finalmente, para la inyección intraventricular, es fácil ver los puntos de sutura coronal para dirigir la pipeta con el objetivo apropiado. Por estas inyecciones, un poco más grande pipetas calibre son necesarios para penetrar el cráneo sin romper la pipeta.
- A continuación, coloque cuidadosamente el útero en la cavidad abdominal. Asegúrese de que no se tuerce sobre sí misma o alrededor de su aporte vascular. Entregar 1 ml de PBS estéril 1X en la cavidad peritoneal de la madre para reemplazar el líquido que se perdió durante el procedimiento. Cerrar la incisión en 2 capas con una sutura trenzada absorbible 5-0 (ex: Vicryl). En primer lugar cerrar la fascia, sin lesionar el intestino subyacente o de la vejiga, y luego cerrar la piel.
- En este momento, después del procedimiento se pueden administrar medicamentos para la analgesia. Volver cada hembra inyecta a su jaula individual y colocar la jaula en una manta térmica. Monitorear el ratón hasta que esté en posición vertical. Poner camas en la jaula y coloque el ratón en una zona tranquila de la instalación del ratón en el que no debe ser alterado (es decir, sin limpiar la jaula) hasta varios días después del parto. Reducir al mínimo cualquier tensión adicional para el animal que disminuirá las posibilidades de un parto prematuro.
- Una vez que haya completado la inyección, limpie su pipeta estéril dos veces con PBS 1X y una vez con EtOH al 70%.
- Hembras inyectadas deben ser observados diariamente para asegurar que se están recuperando de un procedimiento sin dificultad. La incisión debe ser monitoreado por la hinchazón, inflamación de los signos, la separación de la herida, y otros de la infección. Post-operatorio se puede administrar analgésicos si es necesario.
3. Los resultados representativos:
La supervivencia de los fetos inyectadas a la prestación de largo plazo es el principal factor limitante para lograr el éxito con esta técnica. Dependiendo de la inyección de materiales y la cepa de ratón se utilizan, las tasas de supervivencia puede variar. En general, las inyecciones de células hematopoyéticas en ratones de tipo salvaje en el E14 debe dar lugar a por lo menos 50% de los cachorros nacidos vivos. Las mayores tasas de supervivencia son posibles dependiendo de los aspectos técnicos de la inyección, así como las características de los ratones que se inyecta.
Minimizar el trauma de las membranas y líquido amniótico del útero es el aspecto técnico más importante de este protocolo. Sharp, pipetas de pequeño calibre se traducirá en un mínimo trauma del útero durante la inyección. Nosotros no recomendamos el uso de agujas de inyección estándar como el calibre de los pre-fabricados agujas es demasiado grande y se traduciría en un gran agujero en el útero. Hechos a mano pipetas de inyección de vidrio son sólo las agujas de pequeño calibre que pueden ser utilizados en las inyecciones de útero. Técnica quirúrgica cuidadosa y meticulosa, incluyendo el manejo suave del útero y un breve anestésico también es crucial para obtener resultados óptimos.
Características específicas de los ratones receptores tales como los antecedentes genéticos, la edad gestacional y tamaño de la camada también puede afectar a la supervivencia. Ciertas cepas de ratones son más susceptibles a trabajo de parto prematuro y pérdida del embarazo en función de sus antecedentes genéticos. 15 animales transgénicos con defectos musculares o neurodegenerativas pueden tener un deterioro de la capacidad para entregar los fetos por vía vaginal después de someterse a una laparotomía media. 8 Estas mujeres embarazadas pueden requerir la entrega de cesárea. También hemos encontrado que la edad gestacional en el momento de la inyección puede afectar la viabilidad. Los fetos que tienen menos de 12 días embrionarias tienen menores tasas de supervivencia de fetos mayores. Finalmente, hemos encontrado que la basura de gran tamaño (> 10 fetos) tienden a tener mayores tasas de muerte fetal después de la inyección. Atención a los aspectos técnicos de esta técnica y las características específicas de los ratones que se inyecta se puede maximizar la supervivencia de los fetos inyectadas.
ve_content "> Cuando estos métodos se llevan a cabo correctamente, se puede esperar que todos los fetos son expuestos a la sustancia que se inyecta. Similar a la configuración después del parto, sin embargo, la entrega exitosa de las células o virus en el útero no siempre se traduce en el injerto donante de células o genes expresión, respectivamente. El injerto de células madre, por ejemplo, depende de varios factores como la dosis y la fuente de las células trasplantadas. Del mismo modo, el éxito de la transducción viral es, en parte, determinada por el tipo de vector viral utilizado. Hay que entender los numerosos factores que la supervivencia de las crías del impacto, el injerto celular y transducción viral para lograr el éxito con este protocolo.
Figura 1. Diagrama que representa el correcto afilado de las pipetas de inyección (Paso 1.4)
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Discussion
Más de 50 años, Billingham, Brent y Medawar utilizados en el útero de trasplante en ratones para inducir tolerancia inmunológica a proteínas extrañas. 16 Desde entonces, diversas variantes de esta técnica se han utilizado para tratar las cuestiones de la inmunología y la biología de células madre.
El protocolo detallado aquí es uno de los métodos más accesibles para los IUT. El hígado fetal ofrece un blanco fácil de visualizar y proporciona acceso a la circulación sistémica a través del portal y las venas hepáticas. Sin embargo, las modificaciones se han descrito con el fin de optimizar el tiempo y el lugar de la inyección deseado. Por ejemplo, las inyecciones en los fetos de menos de E13.5 puede ser más difícil porque el útero no es transparente. Si este enfoque es necesario estudiar a principios de los acontecimientos en desarrollo, guiada por ecografía inyecciones pueden ser utilizados para desarrollar determinados tejidos. 17 La guía ecográfica también es útil para dirigir la inyección en determinados órganos, como el corazón o los pulmones. Las inyecciones intravenosas en la vena vitelina 18,19 ofrecen la ventaja de entregar directamente a las células en la circulación y puede permitir la entrega de mayores volúmenes de las células. 5 Tenemos intencionalmente describe un enfoque general de llevar a cabo en el IUT de los ratones para que el lector tiene la base necesaria para lograr el éxito con estas inyecciones y puede adaptar estos métodos para la aplicación específica requerida.
A pesar de su uso inicial para estudiar la tolerancia inmunológica más de 50 años, hay preguntas sin respuesta sigue siendo importante para que IUT será instructivo. La capacidad de inducir tolerancia a antígenos específicos de extranjeros por su introducción en el medio ambiente fetal se ha demostrado en ratones. 4,6,7 Mientras que el ratón del sistema inmune del feto se desarrolla más tarde que la de los animales más grandes y pueden influir en este hallazgo, los mecanismos precisos por los que la tolerancia del feto se produce en ratones necesita ser más estudiado. Estos experimentos pueden dilucidar las formas de mejorar la inducción de tolerancia en el ser humano. Incluso en los ratones, los factores tales como la disponibilidad de nichos hematopoyéticos y la ventaja competitiva de las células huésped siguen limitando el éxito del injerto de células madre. 3 Las estrategias actuales para investigar más a fondo esto incluye la manipulación de mecanismos específicos de la respuesta inmune del huésped y la optimización de la ruta, el tiempo y la dosis de entrega con células madre. IUT en ratones la gestación temprana proporciona un modelo ideal para estudiar el injerto de células madre y la diferenciación.
IUT es una poderosa herramienta para comprender las cuestiones fundamentales en las esferas de las células madre y la biología del desarrollo. Definir los mecanismos que conducen a la tolerancia a los antígenos fetales introducido en el útero tendrá importantes implicaciones para el campo del trasplante de células madre. Además, la obtención de vectores virales pueden proporcionar un tratamiento para los trastornos de un único gen. La disponibilidad de numerosas cepas de ratones transgénicos y mutantes permite investigación sobre el papel de genes específicos de juego para alterar el fenotipo esperado. El modelo de ratón del IUT, sin duda, avanzar en estos campos y nos acercan a realizar todo su potencial clínico para el tratamiento de pacientes con anomalías congénitas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Queremos agradecer a nuestras fuentes de financiamiento: El Instituto de Medicina Regenerativa de California Clínica Fellow de Formación Grant (AN), National Science Foundation (MW), Irene Premio Perstein (TCM), Colegio Americano de Cirujanos (MTC), la American Pediatric Surgical Association ( MTC), y la March of Dimes (TCM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipettes | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-30 | |
| Microinjector | Narishige International | IM-300 | |
| Pipette sharpener | Sutter Instrument Co. | Model BV-10 |
References
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