그들의 모국어 microenvironment에서 진화 많은 생물 학적 및 임상 상황에서는 그것은 세포 프로세스를 연구에 유리합니다. 여기 우리는 세포 배양, 동물 실험 및 임상 환자 연구에 실시간 영상을 제공할 수있는 저비 용의 광섬유 현미경의 조립 및 사용에 대해 설명합니다.
많은 생물 학적 및 임상 연구는 세포 수준의 해상도와 형태와 기능의 종단 연구와 분석을 필요로합니다. 전통적으로 여러 실험은 빛의 현미경에 의해 평가를위한 연속적인 시간 지점에서 연구에서 제거 각각의 샘플과 함께 병렬로 실행됩니다. 여러 intravital 기술은 공촛점, multiphoton와 함께 개발하고, 둘째 고조파 현미경은 모든 현장 1 영상에 사용될 자신의 능력을 입증했습니다. 이러한 시스템으로, 그러나 필요한 인프라는 스캐닝 레이저 시스템 및 복잡한 광원을 포함한, 복잡하고 비싼 것입니다. 여기 우리는 5000 미국 $ 이하 부품 – 더 – 선반이 꺼져 사용하여 하루에 만들 수 있습니다 고해상도 microendoscope의 설계 및 조립을위한 프로토콜을 제시한다. 플랫폼은 이미지 해상도 측면에서 유연성을 제공 뷰 필드 및 운영 파장, 우리는 이러한 매개 변수가 쉽게 최종 사용자의 특정 요구를 충족하기 위해 수정할 수있는 방법을 설명합니다.
우리와 다른 excised 6 살아있는 동물의 조직 2,5, 그리고 생체내 2,7 인간의 조직에서 체외 세포 배양 2-5에서에서 고해상도 microendoscope (HRME)의 사용을 살펴 보았다. 사용자 proflavine 2-4, benzoporphyrin – 유도체 monoacid 반지 (럴 – MA) 5, fluoroscein 6,7, 전체를받은 모든 중, 또는 FDA의 investigational 승인 등 여러 가지 형광 대비 요원의 사용을보고 인간의 과목에서 사용하십시오. 고해상도 microendoscopy는 형태로 여기서 설명에 기본 및 임상 과학에서 근무하는 연구자의 다양한 관심을 끌 수 있습니다. 기술은 사용자가 고해상도, 원위치에 세로 이미징을 수행함으로써, 기존의 benchtop 현미경을 보완 효과적이고 경제적인 접근 방식을 제공합니다.
고해상도 microendoscopy 기술은 현재 현장에서 휴대 세부 시각화를위한 유연하고 강력하며 비용 효율적인 방법으로 기본적인 생물 의학 및 임상 연구 분야의 연구자를 제공합니다 설명했다. 우리는 이미징 시스템을 조립을위한 프로토콜을 설명하고 체외에서 세포 배양에의 사용을 시연하고, 생체내의 동물에서 인간 조직했습니다. 여기에 제시된 이미징 결과 형광등 대비 에이전트로 proflavine를 사용하는 동안, 다른 단체는 5-7 다른 염료의 여기 / 방출 스펙트럼과 일치하는 선택한 LED 조명 파장 및 필터 시스템의 버전을 증명하고있다.
해상도와 뷰 필드는 처음 코어로 코어 간격 및 광섬유 번들의 이미징 직경에 따라 결정됩니다. 우리는 약 4 μm의 코어 코어 간격, 그리고 330 μm의 (영화 1), 720 μm의 (그림 2, 그림 3A, B), 그리고 1400 μm의 (그림 3C)의 이미지 직경과 번들을 사용했습니다. 작은 번들은 좁아 게이지 바늘 통과하고 큰 섬유보다 훨씬 더 유연하실 수 있습니다. 우리와 다른 8, 어떤 경우에는, 섬유에서 배출 autofluorescence의 모양 자체가 번들 언급했습니다. UV 파장에 fluorophores을 자극하거나, 빨간 스펙트럼 범위에서 방사를 수집하려고하면, 관심은 전체 측정 신호에 기여 섬유 번들 autofluorescence의 수준으로 지급해야합니다.
고해상도 microendoscopy 작업 대부분의 최신은 노출된 광섬유 번들을 사용했다고 보도되지만, 추가적인 확대가 말초 팁에 보세 미소 렌즈의 사용에 의해 제공될 수 있습니다. 미소 렌즈는 광학 aberrations과 제한된 NA 그들의 자화율이 잘 인식에도 불구하고, 공간 해상도를 높이기 위해 간단한 경제적 방법을 제공합니다. 미소 렌즈 성능은 특정 응용 프로그램, 하이브리드 미소 / 구면 렌즈의 목표 9 미니어처 객관적인 렌즈 어셈블리에 대한 불충 분한 경우에는 10-11을 고용 수 있습니다.
고해상도 microendoscope은 넓은 분야 에피 형광 현미경으로 운영 근본적으로 여기서 설명하므로 더 광학 sectioning (그런 공촛점 또는 비선형 현미경)을 기대하는 것입니다 않습니다. 우리의 경험에서 455 나노미터 여기 가볍고 대비 요원으로 국소 proflavine를 사용하여 조명은 주로 몇 셀 레이어에 해당하는 깊이에서 수집됩니다.
이 프로토콜은 독자가 10의 소형 풋프린트 함께 benchtop에서 "X 8"고해상도 microendoscope 조립 수 있도록 해야지. 원하는 경우, 시스템은 상자에 동봉된 및 전기 부품 (LED와 카메라) 배터리 팩 (그림 1D)에 의해 구동 수 있습니다. 대부분의 컴팩트 카메라는 IEEE – 1394 (파이어 와이어)와 호스트 컴퓨터의 USB 포트에 의해 구동 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 일부 국립 보건원, 그랜트 R01 EB007594, 국방 유방암 연구 프로그램의학과 제안 BCO74699P7, 그리고 수잔 G. 코멘 재단 교부금에 의해 투자 98,188,972분의 26,152되었습니다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | ||
LED | Thorlabs | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Dichroic mirror | Chroma | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Objective lens | Thorlabs (Olympus) | RMS 10X | ||
Tube lens | Thorlabs | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD | |
Condenser lens | Thorlabs | ACL2520 | ||
Cage cube unit | Thorlabs | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | ||
Cage rods and plates | Thorlabs | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | ||
Fold mirror unit | Thorlabs | KCB1, PF10-03-G01 | ||
Lens tubes | Thorlabs | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | ||
Adapters / couplers | Thorlabs | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | ||
SMA connectors | Thorlabs | SM1SMA, 11040A | ||
LED driver | Thorlabs | LEDD1B TPS001 | ||
Fiber optic bundle | Sumitomo | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |