Summary
In veel biologische en klinische situaties is het voordelig om cellulaire processen te bestuderen als ze zich ontwikkelen in hun eigen micro-omgeving. Hier beschrijven we de montage en het gebruik van een low-cost fiber-optische microscoop, die real-time beeldvorming kan bieden in celkweek, dierproeven en klinische studies de patiënt.
Abstract
Veel biologische en klinische studies vereisen de longitudinale studie en analyse van de morfologie en functie met cellulair niveau resolutie. Traditioneel zijn meerdere experimenten parallel lopen, met de individuele monsters uit de studie op opeenvolgende tijdstippen voor de evaluatie met lichtmicroscopie. Verschillende intravitale technieken zijn ontwikkeld, met confocale, multiphoton, en ten tweede harmonische microscopie al tonen hun vermogen om te worden gebruikt voor beeldvorming in situ 1. Met deze systemen, maar de benodigde infrastructuur is complex en duur, waarbij scanning laser systemen en complexe lichtbronnen. Hier presenteren wij een protocol voor het ontwerp en de assemblage van een hoge-resolutie microendoscope die kunnen worden gebouwd in een dag met behulp van off-the-shelf componenten voor minder dan US $ 5.000. Het platform biedt flexibiliteit in termen van beeldresolutie, veld-of-view, en operationele golflengte, en beschrijven we hoe deze parameters kunnen eenvoudig worden aangepast aan de specifieke behoeften van de eindgebruiker te voldoen.
Wij en anderen hebben onderzocht het gebruik van de hoge-resolutie microendoscope (HRME) in in-vitro celkweek 2-5, in weggesneden 6 en leven dierlijke weefsels 2,5, en in menselijke weefsels in vivo 2,7. Gebruikers hebben melding gemaakt van het gebruik van verschillende fluorescerende contrastmiddelen, waaronder proflavine 2-4, benzoporfyrine-afgeleide monoacid ring A (BPD-MA) 5, en fluoroscein 6,7, die alle ontvangen vol is, of onderzoek goedkeuring van de FDA voor gebruik bij de mens. Hoge-resolutie microendoscopy, in de vorm hier beschreven, kan beroep doen op een breed scala aan onderzoekers die werkzaam zijn in de basis-en klinische wetenschappen. De techniek biedt een effectieve en economische aanpak die de traditionele benchtop microscopie een aanvulling op, doordat de gebruiker met hoge resolutie, longitudinale beeldvorming in situ uit te voeren.
Protocol
1. Microendoscope Montage
De hoge resolutie microendoscope hier beschreven (figuur 1a) moet worden beschouwd als een basisconfiguratie met een aantal variaties mogelijk in de montage en toepassing. We beschrijven in detail hier een belichaming van het platform dat is ontworpen voor gebruik met proflavine als een fluorescerende contrastmiddel. Proflavine is een helder nucleaire respectievelijk vlek met piek absorptie en emissie golflengtes van 445 nm en 515 nm. Het gebruik van andere contrastmiddelen vereisen de gebruiker excitatie, emissie-en dichroïde filters de juiste te kiezen. Verschillende elementen van de hoge-resolutie microendoscope generiek zijn en kunnen worden verkregen bij meerdere leveranciers. Bijvoorbeeld, optomechanische positionering componenten zijn verkrijgbaar bij Thorlabs, Newport, Linos onder anderen. Compacte CCD-camera's zijn verkrijgbaar bij bedrijven, waaronder Point Grey Research, Prosilica, en Retiga; cameragevoeligheid moet worden gekozen met inachtneming van de helderheid van de fluorofoor te gebruiken, evenals de gewenste frame rate. High-power light emitting diodes (LED's) kunnen worden verkregen bij Luxeon, Cree, en Nichia onder anderen. Fiber-optische bundels zijn verkrijgbaar bij Sumitomo, Fujikura en Schott. Bij de keuze van componenten voor een specifieke toepassing, dient de gebruiker rekening houden met de relaties die inherent zijn betrokken bij de fluorescentie microscopie tussen de fluorofoor concentratie, fotobleken, verlichting intensiteit, gevoeligheid, winst, en belichtingstijd.
- Sluit het 6 "kooi staven naar de 1,5" kooi staven, om een paar van 7,5 vorm "lange staven. Schroef deze staven in een gezicht van de vouw spiegel unit. Schroef de 0,5" staven in de tegenoverliggende zijde. Schuif de kooi kubus op de kooi staven, via de twee onderste doorlopende gaten. Schroef de 2 "staven in de zijde van de kooi kubus (figuur 1b).
- Bevestig de camera op een kooi plaat met behulp van een C-mount te SM1 adapter. Zet de kooi plaat op het 0,5 "kooi staven, gelijk met het gezicht van de vouw spiegel unit.
- Plaats de "tube" lens in een 3 "lange lens tube en zet de lens met een borgring. De brandpuntsafstand van de lens moet worden gekozen, dat de kernen van de glasvezel-bundel worden bemonsterd door ten minste twee pixels wanneer ze worden geprojecteerd op de camera. Drop de emissie-filter in de buis op de top van de eerste borgring, en nog een ring aan het filter vast te zetten. Let op de filter oriëntatie conventie aangegeven door het filter fabrikant. Schroef de lens buis in de zijkant van de kooi kubus het dichtst bij de CCD camera. Merk op dat in figuur 1c, deze lens en het filter worden getoond zonder de drie "lens tube voor de duidelijkheid.
- Sluit de camera aan een computer en bekijk het beeld op het scherm. Richt de kooi elke montage op een voorwerp in de verte en schuif de kooi kubus langs de rails totdat een beeld verschijnt in beeld. Vergrendelen de kooi kubus op deze locatie. (Dit is een eenvoudige methode om ervoor te zorgen dat de buis lens een scherp beeld te vormen in combinatie met de oneindigheid gecorrigeerde objectief).
- Plaats de dichroïsche spiegel in de houder en plaats bij 45 ° in de kooi kubus.
- Schroef de objectief lens, via een RMS SM1 thread adapter en een verstelbare lens buis, in het gezicht van de kooi kubus tegenover de buis lens houder. Een z-vertaler kan worden gebruikt in plaats van de verstelbare lens buis voor gemakkelijker focussen. Schroef een SMA connector in een kooi bord en monteer dit op de stangen, ongeveer op de werkafstand van de objectieflens.
- Mount een LED op een kooi bord en schuif op het einde van de 2 "staven. Voeg een lens aan een 0.5" lens buis zodanig dat wanneer deze buis is geschroefd in de zijkant van de kooi kubus, het zal een beeld van de LED-formulier dat vult de achterkant diafragma van het objectief. Dit (Kohler verlichting) configuratie zorgt ervoor dat de proximale gezicht van de glasvezel-bundel gelijkmatig verlicht is. Voeg de excitatie filter om de 0,5 "-lens tube en veilig op zijn plaats met een borgring (figuur 1c).
- Bevestig een SMA-connector om een fiber-optische bundel. Schroef de SMA connectorized bundel in de SMA-contactdoos gemonteerd op de kooi staven. Direct het distale uiteinde van de bundel naar een breedband lichtbron (tl-verlichting is voldoende) en observeer het beeld van de bundel proximale gezicht op de CCD-camera. Pas de positie van de objectieflens door schroeven in of uit de kooi kubus tot de vezelbundel foto scherp wordt weergegeven. De afzonderlijke kernen dient duidelijk zichtbaar (figuur 2).
2. GRIN Lens Montage
De ruimtelijke resolutie van de microendoscope kan worden verhoogd door het aanbrengen van een micro-lens of objectief montage aan de distale tip van de vezel bundel. Deze optieken zijn zodanig geconfigureerd dat in plaats van het plaatsen van de bundel tip direct op het weefsel, de tip is afgebeeld op het weefsel oppervlak met demagnification, waardoor de ruimtelijke bemonsteringsfrequentie opgelegd door de licht-guidING kernen van de vezel bundel. De mate van demagnification komt overeen met de toename van de ruimtelijke resolutie, en op hetzelfde moment, een evenredige daling van de field-of-view. Gradient index (GRIN) lens componenten zijn compatibel met glasvezel en zijn verkrijgbaar bij GrinTech, NSG, Schott, onder anderen, en kan direct worden verbonden met het distale uiteinde van een vezel bundel.
- Selecteer een GRIN lens met de gewenste vergroting en werkafstand voor uw toepassing. Zorg ervoor dat de diameter van de lens die van de vezel bundel u van plan bent om te werken met overschrijdt. Wij raden aan dat de vezel bundel en GRIN lens gemonteerd worden op aparte drie-assige manuele positionering stadia onder een laag vermogen microscoop of stereoscoop voor nauwkeurige afstemming voorafgaand aan de binding.
- Plaats een druppel van optische lijm (bijv. Norland UV uithardende lijm) op zowel de lens of bundel gezicht. Breng de twee componenten in contact komen met behulp van de handleiding klepstandstellers. Expose de interface aan UV-licht voor de dosis aanbevolen door de fabrikant.
- Ter bescherming van de GRIN lens en de gebonden-interface, een korte lengte van aluminium capillaire buis (Small Parts Inc) kan worden gebruikt om het gewricht omsluiten. Schuif de slang over de gezamenlijke en vast te zetten met epoxy. Krimpkous kan gebruikt worden om de montage te voltooien.
3. Microendoscope Imaging
- Breng het contrastmiddel aan de cellen of weefsel af te beelden. Met proflavine (0,01% w / v in PBS), kan in vitro beeldvorming van cellen in cultuur worden uitgevoerd door korte incubatie (<1 minuut) en grondig te kunnen spoelen. Beeldvorming van ex vivo weefselmonsters of in vivo weefsels is mogelijk na lokale toediening van de kleurstof. Opname van proflavine onder deze omstandigheden is gevonden om in de buurt-onmiddellijk, met beeldvorming mogelijk is binnen een paar seconden en duren enkele minuten.
- Plaats de optische vezels bundel in het licht contact met het monster af te beelden. Wanneer beeldvorming cellen in cultuur of ex vivo weefselmonsters, is het raadzaam het distale uiteinde van de vezel bundel in een veilige armatuur met handmatige positionering podia XYZ assen voor stabiliteit tijdens de beeldvorming.
4. Representatieve resultaten:
Bij correcte montage, zal de microendoscope opereren als een epi-fluorescentie microscoop, doorgegeven door middel van een coherent fiber-optische bundel. Voor optimale beeldresultaten, moet aandacht worden besteed om ervoor te zorgen dat de drie belangrijke voorwaarden wordt voldaan:
- De proximale gezicht van de vezel bundel moet worden afgebeeld op de CCD-camera zonder defocus, met het oog op de volledige resolutie van het systeem. Figuur 2a, b, c tonen een deel van een vezel bundel afgebeeld met een slechte focus, lichte defocus, en een goede focus, respectievelijk. De optimale focus is gevonden door het aanpassen van de axiale positie van het objectief ten opzichte van de bundel gezicht.
- De proximale gezicht van de vezel bundel moet gelijkmatig worden verlicht over de volledige diameter (field-of-view). Zoals beschreven in het protocol Tekst (1.7), wordt dit bereikt door het configureren van de verlichting optiek voor Kohler verlichting. Figuur 2d toont een afbeelding verworven wanneer een uniform tl-monster is verlicht in de gewenste configuratie, met figuur 2e waaruit de bijbehorende resultaat onder kritische verlichting. In het laatste geval is de structuur van de LED belicht worden op de vezel bundel gezicht, waardoor het uiterlijk van dit ongewenste patroon gelegd op de ware monster structuur.
- Zowel de proximale en distale gezichten van de vezel bundel moet schoon en vrij van krassen en chips. Figuur 2f toont de aanwezigheid van puin aan de bundel gezicht, met schade in de vorm van een kleine chip om 5 uur op de vezel omtrek. Vuil kan worden verwijderd uit de bundel gezichten door het schoonmaken op dezelfde manier als de conventionele glasvezel connectoren, met lens papier en isopropanol, of standaard glasvezel reinigen van gereedschappen. Als een van beide het einde van de vezel bundel is bekrast of afgestoken, of als de bundel breekt over de lengte, het gezicht kan worden gepolijst vlak door standaard handleiding, of mechanisch polijsten technieken. Wij raden aan 12 tot 15 micrometer kabbelende papier voor een eerste grove polish, met een uiteindelijke polish op 0.5-1.0 um papier.
Figuur 3a toont beeldvorming van 1.483 cellen in vitro, na labeling met proflavine en licht de plaatsing van de kale vezelbundel op het monster. Figuur 3b toont de verbetering van de ruimtelijke resolutie en de vermindering in het veld-of-view geleverd door een 2,5 x GRIN lens gebonden aan de bundel tip. Film 1 toont in vivo beeldvorming van het uiervet pad in een muismodel. Hier was een vezelbundel met 0,5 mm buitendiameter (330 um field-of-view) geleid door een 21-gauge naald en geavanceerde in het weefsel. Vetcellen zijn duidelijk zichtbaar, met beweging als gevolg van de hartcyclus duidelijk in deze overname op 15frames per seconde. Figuur 3c toont beeldvorming van het mondslijmvlies in een gezonde menselijke vrijwilligers, dit keer met een grotere vezelbundel met 1,5 mm buitendiameter (1,4 mm field-of-view). In de getoonde alle voorbeelden werd proflavine gebruikt als een nucleaire etikettering fluorescerende contrastmiddel.
Figuur 1. Montage van de hoge-resolutie microendoscope (HRME). (A) Schematische weergave van de HRME systeem. (B) Montage van de belangrijkste opto draagstructuur. (C) toevoeging van optische elementen, verlichting LED en CCD-camera. (D) Foto van de HRME systeem, verpakt in een 10 "x 8" x 2,5 "behuizing.
Figuur 2. Instellen van de HRME. Voorbeelden van beeldvorming met de glasvezel-bundel in (een) slechte focus, (b) dicht bij een goede focus, (c) ideaal focus. In (d), is een uniform fluorescerend richten op distale de bundel tip belicht onder Kohler (uniform) verlichting. (E) een uniforme fluorescerende doel afgebeeld onder kritische verlichting, met de bron-structuur zichtbaar op het object. (F) Losse weefsels en cellen kunnen vasthouden aan de vezel bundel gezicht, die ook gevoelig is voor kleine beschadigingen in haar periferie.
Figuur 3. Beeldvorming met de HRME. (A) 1.483 cellen in vitro, afgebeeld met een kale vezel bundel (IGN-08/30) na labeling met proflavine 0,01% (w / v). (B) Dezelfde 1483 celkweek, zoals aangegeven in (a), afgebeeld met een vezel bundel met 2.5x GRIN lens bevestigd. (C) Afbeelding van normale menselijke mondslijmvlies in vivo, na lokale toediening van proflavine 0,01% (w / v).
Film 1. Imaging het uiervet pad van een muis via het inbrengen van een 450 um buitendiameter vezelbundel binnen het lumen van een 21-gauge naald voorbij in het weefsel. Proflavine 0,01% (w / v) werd geleverd aan de beeldvorming site via dezelfde naald voorafgaand aan het inbrengen van de imaging vezel. Klik hier om video te bekijken
Discussion
De hoge-resolutie microendoscopy techniek die hier beschreven biedt onderzoekers in de basis biomedisch en klinisch onderzoek gebieden met een flexibel, robuust, en kosten-effectieve methode voor het visualiseren van cellulaire detail in situ. We hebben beschreven een protocol voor het monteren van de imaging-systeem en toonde het gebruik ervan in celkweek in vitro en in dierlijke en menselijke weefsels in vivo. Terwijl de beeldvorming hier gepresenteerde resultaten gebruikt proflavine als een fluorescerende contrastmiddel, hebben andere groepen aangetoond versies van het systeem met LED-verlichting golflengten en filters voor gekozen om excitatie / emissie spectra van andere kleurstoffen 5-7 wedstrijd.
Resolutie en field-of-view worden in eerste instantie bepaald door de core-to-core afstand en beeldvorming diameter van de glasvezel-bundel. We hebben gebruik gemaakt bundels met ongeveer 4 micrometer core-kern afstand, en de beeldvorming diameters van 330 micrometer (film 1), 720 micrometer (Figuur 2, Figuur 3a, b), en 1400 um (figuur 3c). De kleinere bundels kunnen worden doorgegeven via smaller gauge naalden en zijn aanzienlijk flexibeler dan de grotere vezels. Wij en anderen 8 hebben, in sommige gevallen, merkte de verschijning van autofluorescentie-uitstoot van de vezel bundel zelf. Bij een poging om fluoroforen prikkelen op UV-golflengten, of emissie in het rode spectrale gebied te verzamelen, moet aandacht worden besteed aan het niveau van de vezelbundel autofluorescentie bij te dragen aan de totale gemeten signaal.
Terwijl de meeste van de hoge-resolutie microendoscopy werk gemeld to-date heeft een kale vezelbundel gebruikt, kan extra vergroting worden geleverd door het gebruik van GRIN lenzen gebonden aan de distale tip. GRIN lenzen bieden een eenvoudige en economische manier om ruimtelijke resolutie te verhogen, hoewel hun gevoeligheid voor optische aberraties en beperkte NA is goed herkend. Als GRIN lens performance is onvoldoende voor een bepaalde toepassing, hybride GRIN / sferische lens doelstellingen 9 of mini-objectief 10-11 assemblies kunnen worden gebruikt.
De hoge resolutie microendoscope hier beschreven in essentie werkt als een wide-field epi-fluorescentie microscoop, dus geen optische sectie (zoals bij confocale microscopie of niet-lineaire) is te verwachten. In onze ervaring, met behulp van 455 nm excitatie licht en actueel proflavine als een contrastmiddel, is licht in de eerste plaats afkomstig van een diepte die overeenkomt met een paar cellagen.
Dit protocol moet in staat stellen de lezer om de hoge-resolutie microendoscope monteren op de werkbank, met een compacte footprint van 10 "x 8". Indien gewenst kan het systeem worden ingesloten in een doos en de elektrische componenten (LED en camera) aangedreven door een accu (Figuur 1d). Veel compacte camera's kunnen worden gevoed door de IEEE-1394 (Firewire) en USB-poorten van de host-computer.
Disclosures
MP en DY hebben niets te onthullen. RRK bezit een patent met betrekking tot microendoscopic beeldvorming platforms.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede gefinancierd door de National Institutes of Health, verlenen R01 EB007594, het Ministerie van Defensie Breast Cancer Research Program, voorstel BCO74699P7, en de Susan G. Komen Foundation verlenen 26152/98188972.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | |
| LED | Thorlabs Inc. | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts |
| Objective lens | Thorlabs Inc. | RMS 10X | |
| Tube lens | Thorlabs Inc. | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD |
| Condenser lens | Thorlabs Inc. | ACL2520 | |
| Cage cube unit | Thorlabs Inc. | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | |
| Cage rods and plates | Thorlabs Inc. | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | |
| Fold mirror unit | Thorlabs Inc. | KCB1, PF10-03-G01 | |
| Lens tubes | Thorlabs Inc. | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | |
| Adapters / couplers | Thorlabs Inc. | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | |
| SMA connectors | Thorlabs Inc. | SM1SMA, 11040A | |
| LED driver | Thorlabs Inc. | LEDD1B TPS001 | |
| Fiber optic bundle | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |
References
- Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer. Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).
- Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope. Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).
- Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).
- Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring. Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).
- Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope. J. Microsc. 207, 108-117 (2002).
- Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -L., Sojic, N. Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle. Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).
- Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles. Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).
- Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).
- Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope. Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).
- Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems. Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).
