在许多生物学和临床的情况下是有利的,以研究细胞过程,因为他们在家乡的微环境演变。在这里,我们描述了一个低成本的光纤显微镜,细胞培养,动物实验和临床病人的研究中可以提供实时成像的组装和使用。
许多生物和临床研究,细胞水平分辨率的形态和功能的纵向研究和分析。传统上,并行运行多个实验,研究进行评估的连续时间点,通过光镜移除的个别样本。已经开发了几个活体技术,共聚焦,多光子和二次谐波显微成像能力在 原地 1展示。然而,有了这些系统,所需的基础设施是复杂和昂贵,涉及激光扫描系统和复杂的光源。在这里,我们现在可以在一天建成使用的,现成的5000美元以下的组件的设计和一个高分辨率的microendoscope大会的协议。该平台提供了灵活性,在图像分辨率方面,场的观点,工作波长,而我们描述了如何将这些参数可以很容易地修改,以满足最终用户的特定需求。
我们和其他人探讨高分辨率microendoscope(HRME) 在体外细胞培养2-5使用,在切除6和活生生的动物组织2,5和2,7 体内的人体组织。用户已经报告了几个不同的荧光造影剂的使用,包括proflavine 2-4苯并卟啉衍生的单酸环A(BPD – MA)5,和fluoroscein 6,7,所有这些都得到了充分的,或研究从美国FDA的批准,在人类受试者使用。高分辨率内窥镜,在这里描述的形式,可以上诉到一个广泛的基础和临床科学的研究人员。该技术提供了一个有效和经济的的方法的补充,使用户能够执行高解析度,在原地纵向成像传统的台式显微镜, 。
高分辨率内窥镜技术的描述,这里提供了一个可视化细胞原位细节的灵活,功能强大,和成本效益的方法基本的生物医学和临床研究领域的研究人员。组装成像系统,我们已经描述了一个协议, 在体外细胞培养表明其使用,并在动物和人体组织在体内。虽然这里介绍的成像结果proflavine作为荧光造影剂,与其他群体已经证明LED照明波长选择5-7其他染料的激发/发射光谱相匹配的过滤器系统的版本。
分辨率和领域的初步确定由核心到核心的间距和成像光纤束的直径。我们已经使用了约4微米的间距,芯芯和成像直径330微米(1电影),720微米(图2,图3A,B),和1400微米(图3c)捆绑。小束可以通过较窄的表针,大大超过弹性较大的纤维。我们和其他8,在某些情况下,注意到从纤维的自体荧光排放外观包本身。当试图在紫外线波长激发的荧光,或在红色光谱范围内收集排放,应注意的整体被测信号的自体荧光纤维束水平。
虽然大部分高清晰度内窥镜的工作报告,至今已经使用了裸纤维束,可提供进一步放大,利用保税远端尖的梯度折射率镜片。梯度折射率透镜提供一个简单和经济的方式,以增加空间分辨率,虽然是众所公认的易感性光学像差和有限娜。如果GRIN透镜的性能不足为特定的应用程序,混合GRIN / 9球面镜片目标或微型物镜组件 10-11可以采用。
高分辨率microendoscope这里描述的基本上为宽视场落射荧光显微镜,因此没有光学切片(如共聚焦或非线性显微镜)是可以预料的。根据我们的经验,用455 nm激发光作为造影剂的外用proflavine,光线主要是收集相应的几个细胞层的深度。
这个协议应该使读者组装台式高分辨率microendoscope,紧凑的面积为10“× 8”。如果需要的话,系统可能会被封闭在一个盒子里,由电池供电(图1d)和电气元件(LED和摄像头)。许多紧凑型相机可以通过IEEE – 1394(火线)和计算机主机的USB端口供电。
The authors have nothing to disclose.
这项研究部分经费由美国国立卫生研究院,授予R01 EB007594,国防部乳腺癌研究计划署的建议BCO74699P7,和苏珊科曼基金会授予98188972分之26152。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | ||
LED | Thorlabs | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Dichroic mirror | Chroma | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Objective lens | Thorlabs (Olympus) | RMS 10X | ||
Tube lens | Thorlabs | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD | |
Condenser lens | Thorlabs | ACL2520 | ||
Cage cube unit | Thorlabs | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | ||
Cage rods and plates | Thorlabs | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | ||
Fold mirror unit | Thorlabs | KCB1, PF10-03-G01 | ||
Lens tubes | Thorlabs | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | ||
Adapters / couplers | Thorlabs | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | ||
SMA connectors | Thorlabs | SM1SMA, 11040A | ||
LED driver | Thorlabs | LEDD1B TPS001 | ||
Fiber optic bundle | Sumitomo | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |