In vielen biologischen und klinischen Situationen ist es vorteilhaft, zelluläre Prozesse zu untersuchen, wie sie sich entwickeln in ihrer Muttersprache Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Montage und die Verwendung eines Low-Cost-Glasfaser-Mikroskop, das Echtzeit-Bildgebung in der Zellkultur, Tierversuche und klinische Patientenstudien bieten kann.
Viele biologische und klinische Studien erfordern die longitudinale Untersuchung und Analyse der Morphologie und Funktion mit zellulärer Ebene Auflösung. Traditionell werden mehrere Experimente in parallel laufen, mit einzelnen Proben aus der Studie bei sequentiellen Zeitpunkte für die Beurteilung durch Lichtmikroskopie entfernt. Mehrere intravital Techniken entwickelt worden, mit der konfokalen, Multiphotonen und zweiten Harmonischen Mikroskopie all ihre Fähigkeit bewiesen, für die Bildgebung in situ 1 verwendet werden. Bei diesen Systemen ist jedoch die erforderliche Infrastruktur komplex und teuer, mit Scanning-Laser-Systeme und komplexe Lichtquellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Konstruktion und Montage von einer hochauflösenden Mikroendoskops, die in einem Tag mit off-the-shelf Komponenten für unter 5.000 US-Dollar gebaut werden kann. Die Plattform bietet Flexibilität bei der Bildauflösung, beschreiben field-of-view, und arbeitet bei der Wellenlänge, und wir, wie diese Parameter leicht modifiziert werden, um die spezifischen Bedürfnisse der Endanwender entsprechen.
Wir und andere haben den Einsatz der hochauflösenden Mikroendoskops (HRME) in in vitro-Zellkultur 2-5 erforscht, in herausgeschnitten 6 und lebenden tierischen Geweben 2,5 und in menschlichen Geweben in vivo 2,7. Die Benutzer haben die Verwendung von mehreren verschiedenen fluoreszierenden Kontrastmittel, einschließlich Proflavin 2-4, Benzoporphyrin-derivative Monosäure Ring A (BPD-MA) 5, und Fluorescein 6,7, die alle voll erhalten haben, oder Forschungszwecke Genehmigung durch die FDA gemeldet für den Einsatz am Menschen. Hochauflösende Mikroendoskopie, in der hier beschriebenen Form kann auf eine breite Palette von Forschern in der Grundlagen-und klinische Wissenschaften appellieren. Die Technik bietet eine effektive und wirtschaftliche Lösung, die traditionelle Benchtop-Mikroskopie ergänzt, indem es dem Benutzer ermöglicht hochauflösende, Längs-Bildgebung in situ durchzuführen.
Das hochauflösende Mikroendoskopie hier beschriebene Technik stellt Forscher in der biomedizinischen und klinischen Forschung Gebieten mit einer flexiblen, robusten und kostengünstigen Methode zur Visualisierung zellulärer Details in situ. Wir haben ein Protokoll für die Montage der Imaging-System beschrieben und demonstriert ihre Verwendung in der Zellkultur in vitro und in tierischen und menschlichen Geweben in vivo. Während die bildgebenden hier vorgestellten Ergebnisse Proflavin als fluoreszierende Kontrastmittel verwendet werden, haben andere Gruppen Versionen des Systems mit LED-Beleuchtung Wellenlängen und Filter gewählt Anregungs / Emissionsspektren anderer Farbstoffe 5-7 Match unter Beweis gestellt.
Auflösung und field-of-view werden zunächst durch die Kern-zu-Kern-Abstand-und Imaging-Durchmesser der Glasfaser-Bündel bestimmt. Wir haben Bundles mit ca. 4 um Kern-Kern-Abstand und Imaging-Durchmesser von 330 um (Film 1), 720 mu m (Abbildung 2, Abbildung 3a, b), und 1400 um (Abbildung 3c) verwendet. Die kleinere Bündel durch engere Gauge-Nadeln weitergegeben werden und sind wesentlich flexibler als die größeren Fasern. Wir und andere 8 haben, in einigen Fällen festgestellt, das Aussehen der Autofluoreszenz-Emissionen aus dem Faserbündel sich. Beim Versuch, Fluorophore bei UV-Wellenlängen anregen, einsammeln oder Emission im roten Spektralbereich, sollten ihr Augenmerk auf das Niveau der Faserbündel Autofluoreszenz Beitrag zur Gesamtentwicklung Messsignal bezahlt werden.
Während die meisten der hoch auflösenden Mikroendoskopie Arbeit berichtet to-date hat eine kahle Faserbündel verwendet werden, können zusätzliche Vergrößerung durch die Verwendung von GRIN-Linsen verbunden mit der distalen Spitze gestellt werden. GRIN-Linsen bieten eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, räumliche Auflösung zu erhöhen, obwohl ihre Anfälligkeit für optische Aberrationen und begrenzte NA gut zu erkennen ist. Wenn GRIN-Linse Leistung ist unzureichend für eine bestimmte Anwendung, Hybrid GRIN / sphärische Linse Ziele 9 oder Miniatur-Objektiv 10-11 Baugruppen können eingesetzt werden.
Das hochauflösende Mikroendoskops hier beschriebenen wesentlichen arbeitet als wide-field epi-Fluoreszenz-Mikroskop, also auch keine optische Schnitte (wie in der konfokalen Mikroskopie oder nichtlineare) zu erwarten ist. In unserer Erfahrung, mit 455 nm Anregungs-und topischen Proflavin als Kontrastmittel wird das Licht in erster Linie aus einer Tiefe, die ein paar Zellschichten gesammelt.
Dieses Protokoll soll dem Leser ermöglichen, die hochauflösende Mikroendoskops am Prüfplatz montieren, mit seinen kompakten Abmessungen von 10 "x 8". Falls gewünscht, kann das System in einer Box eingeschlossen und die elektrischen Komponenten (LED und Kamera) durch einen Akku (Abbildung 1d) mit Strom versorgt. Viele Kompaktkameras kann durch den IEEE-1394 (Firewire) und USB-Ports des Host-Computers mit Strom versorgt werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health, gewähren R01 EB007594, dem Department of Defense Breast Cancer Research Program, Vorschlag BCO74699P7 und die Susan G. Komen Foundation Grant 26152/98188972 finanziert.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | ||
LED | Thorlabs | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Dichroic mirror | Chroma | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Objective lens | Thorlabs (Olympus) | RMS 10X | ||
Tube lens | Thorlabs | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD | |
Condenser lens | Thorlabs | ACL2520 | ||
Cage cube unit | Thorlabs | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | ||
Cage rods and plates | Thorlabs | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | ||
Fold mirror unit | Thorlabs | KCB1, PF10-03-G01 | ||
Lens tubes | Thorlabs | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | ||
Adapters / couplers | Thorlabs | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | ||
SMA connectors | Thorlabs | SM1SMA, 11040A | ||
LED driver | Thorlabs | LEDD1B TPS001 | ||
Fiber optic bundle | Sumitomo | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |