उच्च संकल्प Microendoscopy फाइबर ऑप्टिक के लिए बगल में सेलुलर इमेजिंग

Summary

कई जैविक और नैदानिक ​​स्थितियों में यह सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद है के रूप में वे अपनी मूल microenvironment में विकसित. यहाँ हम विधानसभा और एक कम लागत फाइबर ऑप्टिक माइक्रोस्कोप जो सेल संस्कृति, जानवरों के अध्ययन और नैदानिक ​​रोगी अध्ययन में वास्तविक समय इमेजिंग प्रदान कर सकते हैं उपयोग का वर्णन.

Abstract

कई जैविक और नैदानिक ​​अध्ययन अनुदैर्ध्य और आकारिकी और सेलुलर स्तर संकल्प के साथ समारोह का अध्ययन और विश्लेषण की आवश्यकता है. परंपरागत रूप से, कई प्रयोगों समानांतर में चलाए जा रहे हैं व्यक्तिगत अनुक्रमिक समय बिंदुओं पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के लिए अध्ययन से हटा नमूनों के साथ. कई intravital तकनीक confocal, multiphoton के साथ विकसित किया गया है, और दूसरी हार्मोनिक माइक्रोस्कोपी सभी उनके इमेजिंग के लिए ¹ बगल में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता का प्रदर्शन. इन पद्धतियों के साथ, तथापि, आवश्यक बुनियादी ढांचे जटिल और महंगी है, स्कैनिंग लेजर प्रणाली और जटिल प्रकाश स्रोतों को शामिल. यहाँ हम जो एक बंद-the-शेल्फ घटकों का उपयोग कर 5000 के लिए अमेरिकी डॉलर के तहत दिन में बनाया जा सकता है है डिजाइन और एक microendoscope उच्च संकल्प के विधानसभा के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. मंच छवि संकल्प के संदर्भ में लचीलापन प्रदान करता है, क्षेत्र के देखने के लिए, और ऑपरेटिंग तरंगदैर्ध्य, और हम का वर्णन कैसे इन मानकों को आसानी से करने के लिए अंत उपयोगकर्ता की विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए संशोधित कर सकते हैं.

हम और दूसरों को इन विट्रो ^सेल 2-5 संस्कृति में उच्च संकल्प microendoscope (HRME) का ^{उपयोग} 6 excised और रहने वाले जानवर ^{ऊतकों} 2,5, ^और 2,7 vivo में मानव ऊतकों में पता लगाया है . उपयोगकर्ता proflavine ^2-4, benzoporphyrin व्युत्पन्न monoacid अंगूठी एक ⁵ (BPD एमए), और fluoroscein ^6,7, जो सभी के पूर्ण प्राप्त हुआ है या एफडीए से investigational अनुमोदन सहित, कई अलग अलग फ्लोरोसेंट विपरीत एजेंटों के उपयोग की सूचना दी है मानव विषयों में उपयोग करने के लिए. उच्च संकल्प microendoscopy, फार्म यहाँ वर्णित में, मूल और नैदानिक ​​विज्ञान में काम कर रहे शोधकर्ताओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अपील कर सकते हैं. तकनीक एक प्रभावी और आर्थिक दृष्टिकोण है जो पारंपरिक benchtop माइक्रोस्कोपी, उपयोगकर्ता उच्च संकल्प, बगल में अनुदैर्ध्य इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए सक्षम करने से पूरक प्रदान करता है.

Protocol

1. Microendoscope सभा उच्च संकल्प यहाँ वर्णित microendoscope (आंकड़ा 1a) विधानसभा और आवेदन में कई संभव रूपांतरों के साथ एक आधार विन्यास के रूप में माना जाना चाहिए. हम यहाँ मंच का एक अवतार है जो proflavine के साथ एक फ्लोरोसेंट विपरीत एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा के लिए बनाया गया है विस्तार में वर्णन. Proflavine एक उज्ज्वल परमाणु पीक और 445 एनएम और 515 एनएम के अवशोषण और उत्सर्जन तरंगदैर्य के साथ क्रमशः दाग है. अन्य विपरीत एजेंटों का उपयोग उपयोगकर्ता उत्तेजना, उत्सर्जन, और dichroic फिल्टर का चयन करने के लिए उचित की आवश्यकता होगी. उच्च संकल्प microendoscope के अनेक तत्वों को सामान्य कर रहे हैं और कई विक्रेताओं से प्राप्त किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, optomechanical स्थिति घटक Thorlabs, न्यूपोर्ट, Linos से दूसरों के बीच उपलब्ध हैं. कॉम्पैक्ट सीसीडी कैमरों प्वाइंट ग्रे, अनुसंधान Prosilica, और Retiga सहित कंपनियों से उपलब्ध हैं, कैमरा संवेदनशीलता के लिए इस्तेमाल किया जा fluorophore की चमक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वांछित फ्रेम दर के विचार के साथ चुना जाना चाहिए. उच्च शक्ति प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) दूसरों के बीच Luxeon, क्री, और Nichia से प्राप्त किया जा सकता है. फाइबर ऑप्टिक बंडलों सुमितोमो, Fujikura, और Schott से उपलब्ध हैं. एक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए घटकों का चयन उपयोगकर्ता निहित fluorophore एकाग्रता के बीच प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में शामिल रिश्तों पर विचार, photobleaching, रोशनी की तीव्रता, कैमरा संवेदनशीलता, लाभ, और जोखिम समय चाहिए. पिंजरे छड़ "1.5 से पिंजरे छड़" 6 कनेक्ट करने के लिए 7.5 की एक जोड़ी के रूप में "लंबे समय छड़ गुना दर्पण इकाई के एक चेहरे में इन छड़ों को भाड़ में. 0.5 भाड़ में" विपरीत चेहरे में छड़. पिंजरे छड़ पर पिंजरे घन छेद के माध्यम से कम दो के माध्यम से, स्लाइड. पिंजरे क्यूब (आंकड़ा 1b) की ओर चेहरे में 2 "छड़ भाड़ में. SM1 एडाप्टर के लिए एक C-माउंट का उपयोग करके एक पिंजरे की थाली के लिए कैमरा संलग्न. 0.5 "पिंजरे छड़ पर पिंजरे प्लेट को सुरक्षित करने के लिए, गुना दर्पण इकाई के चेहरे के साथ फ्लश. एक 3 "लंबे लेंस ट्यूब में" ट्यूब "लेंस डालें और एक को बनाए रखना अंगूठी के साथ सुरक्षित लेंस लेंस के फोकल लम्बाई ऐसी है कि फाइबर ऑप्टिक बंडल की कोर कम से कम दो पिक्सल द्वारा नमूना हैं चयनित किया जाना चाहिए जब अनुमान है. कैमरे पर ट्यूब में पहली बनाए रखना है अंगूठी के शीर्ष पर उत्सर्जन फिल्टर, ड्रॉप और एक और अंगूठी जोड़ने के लिए जगह में फिल्टर सुरक्षित फिल्टर अभिविन्यास सम्मेलन निरीक्षण फ़िल्टर निर्माता द्वारा संकेत के पक्ष में लेंस ट्यूब भाड़. पिंजरे सीसीडी कैमरा पास क्यूब ध्यान दें कि आंकड़ा -1 सी में इस लेंस और फिल्टर 3 "स्पष्टता के लिए लेंस ट्यूब के बिना दिखाए जाते हैं. एक कंप्यूटर करने के लिए कैमरा कनेक्ट करें और स्क्रीन पर छवि को देखने के. एक दूर की वस्तु पर पिंजरे विधानसभा प्रत्यक्ष और पटरियों के साथ पिंजरे क्यूब स्लाइड जब तक एक छवि को ध्यान में प्रकट होता है. नीचे इस स्थान पर पिंजरे क्यूब लॉक. (यह सुनिश्चित करना है कि ट्यूब लेंस एक केंद्रित छवि के रूप में जब अनंत सही उद्देश्य लेंस के साथ संयुक्त का एक सरल तरीका है). धारक और पिंजरे क्यूब में 45 डिग्री पर जगह में dichroic दर्पण डालें. उद्देश्य लेंस भाड़ में, SM1 धागा adapter करने के लिए एक RMS और एक समायोज्य लेंस ट्यूब के माध्यम से ट्यूब लेंस धारक के विपरीत पिंजरे क्यूब के चेहरे में. एक z-अनुवादक आसान ध्यान केंद्रित करने के लिए समायोज्य लेंस ट्यूब की जगह में इस्तेमाल किया जा सकता है. भाड़ में एक पिंजरे की थाली में एक SMA संबंधक और छड़ पर इस उद्देश्य लेंस की दूरी पर काम कर लगभग, माउंट. माउंट एक 2 के अंत पर एक पिंजरे की थाली और स्लाइड पर एलईडी लेंस ऐसे ट्यूब है कि जब इस ट्यूब पिंजरे क्यूब के पक्ष में खराब कर दिया है, यह एलईडी की एक छवि के रूप में "छड़ एक 0.5 करने के लिए एक लेंस जोड़ें." कि उद्देश्य लेंस के पीछे एपर्चर भरता है. इस विन्यास (Kohler रोशनी) यह सुनिश्चित करेंगे कि फाइबर ऑप्टिक बंडल के प्रॉक्सिमल चेहरा प्रबुद्ध समान है. 0.5 "लेंस ट्यूब उत्तेजना फिल्टर जोड़ें और एक को बनाए रखना अंगूठी (आंकड़ा -1 सी) के साथ जगह में सुरक्षित है. फाइबर ऑप्टिक एक बंडल के लिए एक SMA संबंधक संलग्न. SMA के पिंजरे छड़ पर घुड़सवार गोदाम में SMA connectorized बंडल भाड़ में. एक ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोत (फ्लोरोसेंट रोशनी पर्याप्त होगा) प्रति बंडल के बाहर का अंत प्रत्यक्ष और सीसीडी कैमरा पर बंडल प्रॉक्सिमल चेहरे की छवि का पालन. में पंगा लेना है या पिंजरे घन के बाहर जब तक फाइबर बंडल छवि को ध्यान में प्रकट होता है उद्देश्य लेंस की स्थिति को समायोजित करें. व्यक्तिगत कोर स्पष्ट रूप से दिखाई (चित्रा 2) होना चाहिए. 2. मुस्कराहट लेंस विधानसभा microendoscope के स्थानिक संकल्प फाइबर बंडल के बाहर का टिप करने के लिए एक माइक्रो लेंस या लेंस विधानसभा संलग्न द्वारा बढ़ाया जा सकता है. ये प्रकाशिकी ऐसी है कि ऊतकों को पर सीधे बंडल टिप रखने की बजाय, टिप demagnification साथ ऊतक की सतह पर imaged है कॉन्फ़िगर कर रहे हैं, जिससे स्थानिक नमूने प्रकाश guid द्वारा लगाया आवृत्ति में वृद्धिआईएनजी कोर फाइबर बंडल के. demagnification की डिग्री क्षेत्र के दृश्य में एक आनुपातिक कमी करने के लिए स्थानिक संकल्प में, और एक ही समय में वृद्धि करने के लिए मेल खाती है. ग्रेडियेंट सूचकांक (खीस) लेंस घटकों फाइबर प्रकाशिकी के साथ संगत कर रहे हैं और GrinTech, एनएसजी, Schott, दूसरों के बीच से उपलब्ध हैं, और सीधे एक फाइबर बंडल के बाहर का टिप करने के लिए बंधुआ कर सकते हैं. वांछित और अपने आवेदन के लिए काम कर दूरी बढ़ाई साथ एक मुस्कराहट लेंस का चयन करें. सुनिश्चित करें कि लेंस के व्यास फाइबर बंडल आप के साथ काम करने के लिए करने की योजना है कि अधिक है. हम अनुशंसा करते है कि फाइबर बंडल और मुस्कराहट लेंस अलग 3 अक्ष पुस्तिका स्थिति चरणों पर एक कम शक्ति या सटीक संरेखण के लिए संबंध के लिए पहले माइक्रोस्कोप स्टिरियोस्कोप के तहत रखा जा. या तो लेंस या बंडल चेहरे पर ऑप्टिकल चिपकने वाला (eg. Norland यूवी इलाज चिपकने वाला) की एक बूंद प्लेस. मैनुअल positioners का उपयोग करके संपर्क में दो घटकों लाओ. निर्माता द्वारा सिफारिश की खुराक के लिए यूवी प्रकाश के लिए इंटरफ़ेस बेनकाब. मुस्कराहट लेंस और बंधुआ अंतरफलक, एल्यूमीनियम केशिका टयूबिंग (लघु पार्ट्स इंक) की एक छोटी लंबाई की रक्षा संयुक्त लगा देना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संयुक्त और epoxy के साथ जगह में सुरक्षित पर टयूबिंग स्लाइड. हीट हटना टयूबिंग विधानसभा को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3. Microendoscope इमेजिंग कोशिकाओं या ऊतकों को imaged किया जा करने के लिए इसके विपरीत एजेंट लागू करें. Proflavine (0.01% w / पीबीएस में ध्) के साथ, इन विट्रो संस्कृति में कोशिकाओं के इमेजिंग में संक्षिप्त ऊष्मायन (<1 मिनट) और पूरी तरह से rinsing द्वारा निष्पादित किया जा सकता है है. पूर्व vivo ऊतकों के नमूनों की या vivo में ऊतकों में इमेजिंग संभव डाई निम्नलिखित सामयिक आवेदन है . Proflavine की इन शर्तों के तहत तेज करने के लिए पास तात्कालिक कुछ ही सेकंड और कई मिनट के लिए स्थायी भीतर संभव इमेजिंग के साथ किया जा पाया गया है. Imaged किया जा नमूने के साथ संपर्क में प्रकाश फाइबर ऑप्टिक बंडल रखें. जब संस्कृति या पूर्व vivo ऊतक नमूनों में इमेजिंग कोशिकाओं, हम इमेजिंग के दौरान स्थिरता के लिए XYZ अक्षों पर मैनुअल पोजीशनिंग चरणों के साथ एक सुरक्षित स्थिरता में फाइबर बंडल के बाहर का अंत बढ़ते सलाह देते हैं . 4. प्रतिनिधि परिणाम: जब सही ढंग से इकट्ठा, एक महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, एक सुसंगत बंडल फाइबर ऑप्टिक के माध्यम से relayed microendoscope के रूप में काम करेंगे. इष्टतम इमेजिंग परिणामों के लिए, ध्यान सुनिश्चित करना है कि तीन प्रमुख शर्तें पूरी कर रहे हैं भुगतान किया जाना चाहिए: फाइबर बंडल के प्रॉक्सिमल चेहरा defocus बिना सीसीडी कैमरा पर imaged किया जाना चाहिए क्रम में सिस्टम के पूर्ण संकल्प को प्राप्त करने. चित्रा 2a, ख, ग एक फाइबर बंडल के हिस्से गरीब ध्यान देने के साथ imaged, मामूली defocus, और अच्छा ध्यान केंद्रित क्रमशः प्रदर्शन,. इष्टतम ध्यान उद्देश्य लेंस का बंडल चेहरे के सापेक्ष अक्षीय स्थिति समायोजन करके पाया जाता है. फाइबर बंडल के प्रॉक्सिमल चेहरा समान रूप से अपनी पूरी व्यास (क्षेत्र के दृश्य) पर प्रबुद्ध किया जाना चाहिए. प्रोटोकॉल पाठ (1.7) में वर्णित है, इस Kohler रोशनी के लिए रोशनी प्रकाशिकी विन्यस्त करके हासिल की है. चित्रा 2d एक अधिग्रहीत जब एक वर्दी फ्लोरोसेंट नमूना इस पसंदीदा विन्यास में प्रबुद्ध है, चित्रा 2e महत्वपूर्ण रोशनी के तहत इसी परिणाम प्रदर्शन के साथ, छवि दिखाता है. उत्तरार्द्ध मामले में, एलईडी की संरचना फाइबर बंडल चेहरे पर imaged है, इस अवांछित सच नमूना संरचना पर आरोपित पैटर्न की उपस्थिति में जिसके परिणामस्वरूप. दोनों फाइबर बंडल के प्रॉक्सिमल और डिस्टल चेहरे स्वच्छ और खरोंच और चिप्स के मुक्त होना चाहिए. चित्रा 2 एफ फाइबर परिधि पर 5 बजे एक छोटी सी चिप के रूप में क्षति के साथ बंडल सामना करने के लिए संलग्न मलबे की उपस्थिति को दर्शाता है. परंपरागत फाइबर ऑप्टिक connectors के रूप में एक ही फैशन में, सफाई लेंस कागज और isopropanol, या मानक फाइबर ऑप्टिक उपकरणों की सफाई के साथ बंडल चेहरे से मलबा हटाया जा सकता है. यदि फाइबर बंडल के या तो अंत खरोंच है या chipped, या अगर बंडल इसकी लंबाई के साथ टूटता है, चेहरे मानक मैनुअल, या यांत्रिक चमकाने तकनीक द्वारा फ्लैट पॉलिश हो सकता है. हम एक प्रारंभिक मोटे पॉलिश के लिए 12-15 कागज lapping सुक्ष्ममापी 0.5-1.0 सुक्ष्ममापी कागज पर अंतिम पॉलिश के साथ सलाह देते हैं. चित्रा 3a नमूने पर नंगे फाइबर बंडल के proflavine और प्रकाश स्थान के साथ लेबलिंग के बाद, इन विट्रो में 1483 कोशिकाओं की इमेजिंग दर्शाता है. चित्रा 3b स्थानिक संकल्प और एक 2.5x मुस्कराहट बंडल टिप करने के लिए बंधुआ लेंस द्वारा प्रदान की क्षेत्र के दृश्य में कमी में सुधार दर्शाता है. 1 मूवी स्तन वसा पैड के एक माउस मॉडल में vivo इमेजिंग में दर्शाता है . यहाँ, 0.5 मिमी बाहरी व्यास (330 सुक्ष्ममापी क्षेत्र के देखने) के साथ एक फाइबर बंडल एक 21 गेज सुई के माध्यम से पारित किया गया था और ऊतकों में उन्नत. फैट कोशिकाओं स्पष्ट रूप से दिखाई दे 15 में इस अधिग्रहण में हृदय स्पष्ट चक्र के कारण गति के साथ कर रहे हैं,फ्रेम प्रति सेकंड. चित्रा -3 सी एक स्वस्थ मानव स्वयंसेवक में मौखिक mucosa के इमेजिंग, इस समय 1.5 मिमी की बाहरी व्यास (1.4 मिमी क्षेत्र के दृश्य) के साथ एक बड़ा फाइबर बंडल का उपयोग को दर्शाता है. सभी उदाहरणों में दिखाया गया है, proflavine परमाणु लेबलिंग फ्लोरोसेंट विपरीत एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था. चित्रा 1 कोडांतरण उच्च संकल्प microendoscope (HRME).. (क) HRME प्रणाली के योजनाबद्ध आरेख. (ख) मुख्य optomechanical समर्थन संरचना की विधानसभा. (ग) ऑप्टिकल तत्वों के अतिरिक्त, रोशनी एलईडी, और सीसीडी कैमरा. HRME प्रणाली की तस्वीर (घ), एक 10 "x 8" x 2.5 "बाड़े में पैक. चित्रा 2 HRME स्थापना. इमेजिंग (क) गरीब ध्यान केंद्रित में फाइबर ऑप्टिक बंडल के साथ उदाहरण, (ख) अच्छा ध्यान केंद्रित करने के लिए बंद करने के लिए, (ग) आदर्श ध्यान केंद्रित. (घ), बंडल बाहर का टिप पर एक समान लक्ष्य फ्लोरोसेंट Kohler रोशनी (वर्दी) के तहत imaged है. (ङ) एक वर्दी फ्लोरोसेंट लक्ष्य महत्वपूर्ण रोशनी के तहत, ऑब्जेक्ट को स्रोत स्पष्ट संरचना के साथ, imaged. (च) ढीला ऊतकों और कोशिकाओं फाइबर बंडल चेहरा है, जो भी इसकी परिधि में मामूली क्षति करने के लिए प्रवण करने के लिए छड़ी कर सकते हैं. चित्रा 3 HRME साथ इमेजिंग. (क) इन विट्रो में 1483 कोशिकाओं, एक नंगे फाइबर बंडल (IGN-08/30) proflavine 0.01% (w / v) के साथ लेबलिंग के बाद के साथ imaged. (ख) एक ही 1483 सेल संस्कृति के रूप में दिखाया गया है (क), 2.5x मुस्कराहट लेंस संलग्न के साथ एक फाइबर बंडल के साथ imaged. (ग) vivo में सामान्य मानव मौखिक mucosa की छवि proflavine 0.01% की सामयिक आवेदन (w / v) के बाद . मूवी 1. इमेजिंग एक 450 सुक्ष्ममापी में एक 21 गेज ऊतक में पारित सुई के लुमेन के भीतर बाहरी व्यास फाइबर बंडल की प्रविष्टि के माध्यम से एक माउस के स्तन वसा पैड. Proflavine 0.01% (w / v) एक ही सुई के माध्यम से इमेजिंग साइट इमेजिंग फाइबर के सम्मिलन से पहले दिया गया था . लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के

Discussion

उच्च संकल्प microendoscopy तकनीक वर्णित यहाँ बगल में सेलुलर विस्तार दृश्यमान करने के लिए एक लचीला, मजबूत, और लागत प्रभावी विधि के साथ बुनियादी जैव चिकित्सा और नैदानिक ​​अनुसंधान के क्षेत्रों में शोधकर्ताओं प्रदान करता है. हम इमेजिंग प्रणाली कोडांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है और इन विट्रो में सेल संस्कृति में इसके उपयोग का प्रदर्शन किया है, और जानवर में और vivo में मानव ऊतकों. जबकि यहाँ प्रस्तुत इमेजिंग परिणाम एक फ्लोरोसेंट विपरीत एजेंट के रूप में proflavine प्रयोग किया जाता है, अन्य समूहों एलईडी रोशनी तरंगदैर्य ^और अन्य 5-7 रंगों के / उत्तेजना उत्सर्जन स्पेक्ट्रा मैच चुना फिल्टर के साथ प्रणाली के संस्करणों का प्रदर्शन किया है.

संकल्प और क्षेत्र के देखने के शुरू में रिक्ति कोर – कोर और बंडल फाइबर ऑप्टिक इमेजिंग व्यास द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. हम लगभग 4 सुक्ष्ममापी कोर कोर रिक्ति, इमेजिंग और 330 सुक्ष्ममापी (1 फिल्म), 720 सुक्ष्ममापी (चित्रा 2, चित्र 3a, ख), और 1400 सुक्ष्ममापी (चित्रा -3 सी) के व्यास के साथ बंडलों का इस्तेमाल किया है. छोटे बंडलों संकरा गेज सुई के माध्यम से पारित कर दिया जा सकता है और काफी अधिक बड़ा फाइबर से अधिक लचीला कर रहे हैं. हम और ⁸ अन्य, कुछ मामलों में उल्लेख किया है, फाइबर से autofluorescence उत्सर्जन की उपस्थिति ही बंडल. जब यूवी तरंगदैर्य पर fluorophores उत्तेजित, या लाल वर्णक्रमीय रेंज में उत्सर्जन एकत्र करने का प्रयास, फाइबर बंडल autofluorescence समग्र मापा संकेत करने के लिए योगदान के स्तर पर ध्यान दिया जाना चाहिए.

जबकि उच्च संकल्प microendoscopy काम के सबसे करने की तारीख की रिपोर्ट एक नंगे फाइबर बंडल इस्तेमाल किया गया है, अतिरिक्त बढ़ाई मुस्कराहट बाहर का टिप करने के लिए बंधुआ लेंस के उपयोग के द्वारा उपलब्ध कराया जा सकता है. मुस्कराहट लेंस एक सरल और किफायती तरीका प्रदान करते हैं स्थानिक संकल्प में वृद्धि, हालांकि उनके ऑप्टिकल aberrations और सीमित एनए के लिए संवेदनशीलता को अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है. यदि मुस्कराहट लेंस प्रदर्शन एक विशेष आवेदन, संकर मुसकान / गोलाकार लेंस उद्देश्यों ⁹ या लघु उद्देश्य लेंस असेंबलियों के लिए अपर्याप्त ^है 10-11 नियोजित किया जा सकता है.

microendoscope उच्च संकल्प अनिवार्य रूप से यहाँ वर्णित एक व्यापक क्षेत्र महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के रूप में संचालित है, इसलिए कोई ऑप्टिकल सेक्शनिंग (के रूप में confocal या nonlinear माइक्रोस्कोपी में) उम्मीद की जानी है. हमारे अनुभव में, 455 एनएम उत्तेजना प्रकाश और एक विपरीत एजेंट के रूप में सामयिक proflavine का उपयोग कर, प्रकाश मुख्य रूप से एक कुछ सेल परतों को इसी गहराई से एकत्र किया जाता है.

इस प्रोटोकॉल के लिए पाठक benchtop पर microendoscope उच्च संकल्प इकट्ठा करने के लिए, 10 के एक कॉम्पैक्ट पदचिह्न के साथ "x 8" सक्षम चाहिए. अगर वांछित, सिस्टम एक बॉक्स में संलग्न किया जा सकता है और बिजली के घटकों (एलईडी और कैमरा) एक बैटरी पैक (चित्रा 1 दिन) के द्वारा संचालित है. कई कॉम्पैक्ट कैमरे आईईईई 1394 (FireWire) और मेजबान कंप्यूटर के यूएसबी पोर्ट के द्वारा संचालित किया जा सकता है है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
CCD camera		Point Grey Research	GRAS-14S5M
LED		Thorlabs	M455L2	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Excitation filter		Semrock	452/45	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Emission filter		Semrock	550/88	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Dichroic mirror		Chroma	485 DCLP	Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts
Objective lens		Thorlabs (Olympus)	RMS 10X
Tube lens		Thorlabs	AC-254-150-A1	Select focal length to achieve required magnification to CCD
Condenser lens		Thorlabs	ACL2520
Cage cube unit		Thorlabs	C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2
Cage rods and plates		Thorlabs	ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)
Fold mirror unit		Thorlabs	KCB1, PF10-03-G01
Lens tubes		Thorlabs	SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)
Adapters / couplers		Thorlabs	SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)
SMA connectors		Thorlabs	SM1SMA, 11040A
LED driver		Thorlabs	LEDD1B TPS001
Fiber optic bundle		Sumitomo	IGN-08/30	Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)