Summary
نقدم بروتوكول لانتاج المستضد محددة الماوس T - تنبيغ الخلايا باستخدام فيروسات
Abstract
مستقبلات الخلية T - (TCRs) تلعب دورا مركزيا في النظام المناعي. يمكن TCRs على سطوح الخلايا T - تعترف تحديدا مستضدات الببتيد التي قدمها مستضد تقديم الخلايا (ناقلات الجنود المدرعة) 1. هذا الاعتراف يؤدي الى تنشيط خلايا تي وسلسلة من النتائج الفنية (مثل إنتاج السيتوكينات ، وقتل الخلايا المستهدفة). فهم دور وظيفي للTCRs أمر بالغ الأهمية لتسخير قوة جهاز المناعة لعلاج العديد من الأمراض المتصلة المناعة (سرطان على سبيل المثال أو المناعة الذاتية).
أنه لأمر مريح للدراسة في نماذج TCRs الماوس ، والذي يمكن أن يتحقق بعدة طرق. صنع نماذج الماوس المعدلة وراثيا TCR مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وحاليا لا يوجد سوى عدد محدود منهم المتاحة 2-4. بدلا من ذلك ، يمكن أن تتولد الفئران مع مستضد محددة خلايا تي من قبل نخاع العظم وهم. هذا الأسلوب يستغرق عدة أسابيع أيضا ، ويتطلب خبرة 5. تنبيغ من فيروسات TCRs في المختبر في الماوس تنشيط خلايا تي هو وسيلة سريعة وسهلة نسبيا للحصول على خلايا تي من التحديد الببتيد MHC - المرجوة. يمكن أن تتولد مستضد محددة (خلايا تي) في أسبوع واحد وتستخدم في أي تطبيقات المصب. دراسة transduced الخلايا التائية كما التطبيق المباشر لالمناعي البشري ، ونقل بالتبني من الخلايا البشرية transduced - T مع TCRs محددة مستضد هو استراتيجية الناشئة لعلاج السرطان 6.
هنا نقدم بروتوكول لتنبيغ retrovirally TCRs في المختبر الى تنشيط خلايا تي الماوس. ويمكن استخدام كل من جينات الإنسان والفأر TCR. يتم إنشاء الفيروسات القهقرية تحمل جينات محددة TCR واستخدامها لتصيب الماوس تنشيط خلايا تي مع أضداد CD3 ومكافحة CD28. بعد التوسع في المختبر ، ويتم تحليل transduced الخلايا التائية التي التدفق الخلوي.
Protocol
1. إعداد أنشئ فيروسات الرجعية
- الفرعي استنساخ الخلايا T - مستقبلات (TCR) الجينات ذات الاهتمام الموجه إلى فيروس (الشكل 1 ، وناقلات المثال pMSG 7 ، 5،8 pMIGII ، pMXs من Cellbiolabs). يجب أن α β TCR وسلسلة الجينات يكون على نفس ناقلات تحت سيطرة المروج نفس التعبير لضمان المساواة. إذا كان من مصلحة TCR هو الإنسان ، والمجالات الإنسانية ثابتة يجب أن يتم استبداله المجالات الماوس المستمر 9. ملاحظتنا أن TCRs كامل طول الإنسان لا تعبر عن ستابلي على الماوس الخلايا التائية.
- إعداد عالية الجودة DNA البلازميد باستخدام أدوات Qiagen ماكسي الإعدادية أو منتج مماثل. وينبغي تركيز البلازميد تكون في حدود 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
2. ترنسفكأيشن وعزل خلايا T
اليوم -1 (خلايا التغليف بلايت)
- طرد البلاتين - E (بلات - E ، Cellbiolabs) خلايا التعبئة والتغليف مع فيروسات التربسين - EDTA وتحييد وسائل الإعلام مع DMEM.
- الطرد المركزي الخلايا في 1000 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف بيليه resuspend في الخلية في وسائل الإعلام DMEM.
- تحديد عدد الخلايا والخلايا في تمييع 0.6x10 6 / مليلتر. لوحة 10 مل من تعليق خلية في بولي يسين المغلفة 10MM نسيج لوحة الثقافة وتنمو بين عشية وضحاها في الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2.
اليوم 0 (ترنسفكأيشن)
- في صباح اليوم التالي ، لفحص الخلايا تحت المجهر الخفيفة. وينبغي أن تكون هذه الخلايا ما يقرب من 80 ٪ متموجة.
- إزالة بلطف وسائل الإعلام من لوحة. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 10 مل قبل تحسنت ، طازجة DMEM سائل الاعلام من دون البنسلين ، الستربتوميسين (القلم / بكتيريا).
(ملاحظة : القلم / بكتيريا يمكن أن تتداخل مع ترنسفكأيشن) - إعداد ترنسفكأيشن المعقدة.
تحضير مزيج A و B على النحو التالي :مزيج ج : DNA البلازميد 9 ميكروغرام PCL - ايكو المساعد البلازميد 6.3 ميكروغرام OptiMEM 1.5 مل مزيج B : Lipopfectime 2000 60 ميكرولتر OptiMEM 1.5 مل
احتضان ألف وباء بشكل منفصل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة
مزيج A و B معا بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل مجمع ترنسفكأيشن. - بالتنقيط ببطء الخليط (المجموع 3 مل) في الخلايا بلات - E. صخرة بلطف لوحة ذهابا وإيابا لتوزيع الخليط بالتساوي ترنسفكأيشن.
- احتضان خلايا في 37 ° C CO / 5 2 ٪ في حاضنة الخلية.
- بعد 6-8 ساعات ، استبدل المتوسطة مع 10 مل من المتوسط DMEM جديدة (مع القلم / بكتيريا) لإنتاج الفيروسية.
طبق معطف مع الأضداد
- الماوس الخلايا التائية ضرورة تفعيلها قبل تنبيغ الفيروسية. هناك طرق متنوعة لتنشيط خلايا تي. هنا نستخدم لوحة ملزمة أضداد CD3e ومكافحة CD28. يعد خليط الضد من 1 ميكروغرام / مل من CD3e المضادة للطائرات و2 ميكروغرام / مل من CD28 للسامية في برنامج تلفزيوني العقيمة.
- الاستغناء عن 250 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة إلى كل بئر من لوحة نسيج الثقافة 24 أيضا. يمكن أن تكون مغلفة لوحة بين عشية وضحاها في 4 ساعات 2 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية.
إعداد وحيدة الخلية تعليق من الطحال الماوس
- حصاد الطحال الماوس ونقل إلى متوسطة RPMI.
- مكان الطحال في مصفاة الخلية. الهريس والطحال مع المكبس حقنة في لوحة 5 سم زراعة الأنسجة. شطف الخلايا قبالة مصفاة زنزانة مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
- الطرد المركزي XG 1000 ، 5 دقائق.
- تجاهل طاف. Resuspend بيليه في الخلية العازلة lysing ACK (2 مل في الطحال). احتضان 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة RPMI المتوسطة ما يصل الى 20 مل وأجهزة الطرد المركزي 1000 x ج لمدة 5 دقائق.
- تجاهل طاف. Resuspend الخلية بيليه في برنامج تلفزيوني العقيمة. تحديد عدد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي XG 1000 لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. انتقل إلى عزل الخلايا التائية.
العزلة وتنشيط خلايا تي الماوس
- تسمية الخلايا مغناطيسيا وفقا لدليل المنتج (CD8 + T - العزلة عدة خلية من Miltenyi بيوتيك).
- مكان عمود LS (Miltenyi بيوتيك) في مagnetic الميدان. تطبيق المسمى تعليق على خلية العمود. جمع التدفق من خلال (المخصب الماوس CD8 + الخلايا التائية). يغسل ثلاث مرات مع العمود العازلة مل 3 وفقا لدليل المنتجات وتتحد مع السابقة من خلال تدفق.
- وصمة عار الخلايا مع أضداد CD3e ومكافحة CD8a وتحليلها حسب التدفق الخلوي (الشكل 2A). لفصل نموذجي ، يمكن أن تكون معزولة ~ 8-10 ٪ من مجموع الخلايا. ~ 90 ٪ من خلايا منعزلة وCD8 + الخلايا التائية.
- أجهزة الطرد المركزي في الخلايا XG 1000 ، 5 دقائق. تجاهل طاف. Resuspend الكرية خلية في المتوسط RPMI المؤتلف مع 2 - IL الإنسان (rhIL2 ، 20 نانوغرام / مل) في 1x10 6 / مليلتر.
- فقط قبل إضافة الخلايا ، وإزالة الأجسام المضادة من حل لوحة (المعدة مسبقا في 2.11). شطف جيدا مع كل برنامج تلفزيوني في برنامج تلفزيوني العقيمة وإزالته.
- إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر. وضع لوحة في 37 ° / C 5 ٪ CO 2 في حاضنة الخلية.
3. (يوم ويوم 2 3) العدوى من الخلايا التائية المنشطة
- 2 بعد أيام من إنتاج الفيروس ، ويجب على المديين المتوسط في لوحة الخلية بلات - E تصبح صفراء. طاف الفيروسية لنقل أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 10 مل من المتوسط DMEM جديدة لوحة لإنتاج مزيد من الفيروسات (اختياري).
- طاف الفيروس في جهاز الطرد المركزي 1000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا الحطام. طاف بعناية نقل الفيروس إلى أنبوب جديد. ترك بعض السائل في الجزء السفلي من الأنبوب وعدم تعكير صفو حطام الخلايا.
- جمع تنشيط خلايا تي من لوحة إلى أنبوب مخروطي 50 مل. تحديد عدد الخلايا. انقاذ بعض الخلايا في أنبوب منفصل يمكن استخدامها لمكافحة (UN - transduced) سلبية. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
- Resuspend الكرية خلية في طاف الفيروس في الخلايا 6 10 لكل 1 مل مع rhIL2 نانوغرام / مل 20 و 10 ميكروغرام / مل سلفات بروتامين. إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحة البئر 24. Resuspend الخلايا في الأنبوب التحكم في المتوسط RPMI في كثافة الخلية نفسها مع نفس الكمية من سلفات بروتامين rhIL2 و. إضافة إلى لوحة الخلايا نفسها.
- التفاف لوحة مع فيلم من البلاستيك. أجهزة الطرد المركزي في 90 دقيقة XG 2000 ، في 32 درجة مئوية مع عدم وجود الفرامل.
- بعد الطرد المركزي ، وإزالة الفيلم من البلاستيك. إضافة 1 مل من المتوسط RPMI الطازجة مع 20 نانوغرام / مل rhIL2 إلى كل بئر. وضع لوحة العودة إلى الحاضنة.
- يمكن (اختياري) يمكن تحقيق المستوى العالي من التعبير عن طريق جمع TCR طاف الفيروس والعدوى تكرار الإجراء في اليوم 3.
4. توسيع الخلايا وتقييم كفاءة تنبيغ
- فحص خلايا تي transduced اليومية. انقسام الخلايا في نسب 01:03 عند الضرورة في rhIL2 RPMI المتوسطة. لا تدع اكتسى الخلايا (المتوسط يتحول إلى اللون الأصفر).
- في يوم 6 أو 7 أيام ، وصمة عار على الأجسام المضادة والخلايا مع MHC tetramer محددة لTCR لتقييم التعبير عن TCR على سطح الخلايا التائية. استخدام الامم المتحدة transduced الخلايا التائية كما التحكم (الشكل 2C).
- وtransduced الخلايا التائية مستعدون لمزيد من التطبيقات المصب.
5. ممثل النتائج
غالبا ما يكون من المفيد لتنقية تي خلية فرعية قبل تنبيغ الرغم من أنه يمكن splenocytes transduced دون تنقية. ويمكن الحصول على نقاوة عالية تي خلية فرعية باستخدام الخرز المغناطيسي التجارية (الشكل 2A).
لتقييم مستوى التعبير عن TCRs على خلايا - T ، ويمكن استخدام الأجسام المضادة المحددة لألفا TCR أو سلاسل بيتا. عادة 30 ٪ إلى 80 ٪ من الخلايا يمكن أن تعبر عن transduced TCR (الشكل 2B) اعتمادا على جينات الفيروس TCR والتتر. ويمكن أيضا MHC tetramer محددة لTCR يمكن استخدامها لمزيد من التحقق من التعبير الوظيفي للTCRs (الشكل 2C).
الشكل 1. مثال على الجين تي مستقبلات الخلية المستنسخة بناء الفرعي في ناقلات فيروسات. ترتبط كامل طول ألفا وبيتا سلسلة الجينات بواسطة رابط 2A الببتيد الذاتي شطورة 8.
الشكل 2. مثال ناجح والعزلة تنبيغ من الماوس الخلايا التائية (أ) تم عزل الخلايا التائية CD8 من splenocytes CD8a باستخدام الخلايا T + كيت عزل (Miltenyi بيوتيك) وملطخة أضداد CD3e ومكافحة CD8a. عزل الخلايا التائية CD8 كانت transduced مع R6C12 TCR محددة لgp100 الإنسان : 209 -217 4 الببتيد وملطخة المضادة للجسم البشري Vbeta 8 (ب) و HLA - A2kb gp100 tetramer (ج).
Discussion
عدة خطوات حاسمة من أجل تحقيق أفضل النتائج. يجب أن تبقى بلات - E خط التعبئة والتغليف في الخلية حالة صحية جيدة. إذا لزم الأمر ، يمكن passaged الخلايا بضع مرات في المتوسط مع DMEM 1 ميكروغرام / مل بوروميسين ، ميكروغرام / 10 مل blasticidin لمنع فقدان فيروسات هيكل بروتين تعبير. يوم ترنسفكأيشن ، ينبغي أن تكون الخلايا ~ متموجة 80 ٪. قد خلايا قليلة جدا أو كثيرة جدا تقلل من عيار الفيروس. يمكن التحقق من نوعية الفيروس عن طريق اختبار على خطوط الخلية التي يمكن transduced بسهولة. منذ TCRs يتطلب أعرب CD3 المجمعات على سطح الخلية ، ونحن نستخدم بشكل روتيني 58α-/β- خلايا ورم هجين 10 (خط الخلية التي لا تعبر عن الذاتية أو سلسلة TCR α β ، لكن التعبير عن CD3 المعقدة). نحصل على ما يقرب من 100 ٪ من الكفاءة تنبيغ الخلايا خلايا ورم هجين عندما transducing مع 1 مل من طاف الفيروس. وأخيرا ، فإن الخلايا التائية ضرورة تفعيلها وبسبب تكاثر الفيروس الارتجاعي يمكن أن تصيب فقط تقسيم بنشاط الخلايا.
قدم هنا طريقة لإنتاج محددة مستضد الخلايا التائية عدة قيود. الأول ، أنه من الصعب أن تصل إلى 100 ٪ كفاءة تنبيغ للماوس الأولية (خلايا تي). جزء من خلايا لا تعبر عن TCR المصالح. ثانيا ، transduced TCR α β وسلاسل يمكن mispair TCRs الذاتية مع 9 ، التي قد تقلل من مستوى التعبير TCR المصالح. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتسبب TCRs mispaired المناعة الذاتية في الجسم الحي 11. أخيرا ، ليس هناك سوى فترة زمنية محدودة transduced الخلايا التائية يمكن استخدامها. بعد حوالي أسبوع واحد ، والخضوع لموت الخلايا المبرمج الخلايا ما لم يتم إعادة حفز. ومع ذلك ، قد تصبح استنفاد الخلايا وفقدان الوظائف المتكررة مع إعادة التحفيز.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5U01CA137070) والجمعية الأميركية للسرطان (RSG - 09 - 070 - 01 - LIB) ، وهو معهد أبحاث السرطان محقق جائزة (MK) ، وجمعية القلب الأميركية قبل الدكتوراه زمالة (كم) و وزارة التربية والتعليم الاسبانية والعلوم زمالة (APG).
نود أن نشكر الدكتور نيكولاس Restifo والدكتور Zhiya يو (NIH / NCI) للحصول على اقتراحات مفيدة للبروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
