Summary
Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução retroviral
Abstract
Receptores de células T (TCRs) desempenham um papel central no sistema imunológico. TCRs na T-cell superfícies podem especificamente reconhecer antígenos peptídeos apresentados por células apresentadoras de antígenos (APCs) 1. Este reconhecimento leva à ativação de células T e uma série de resultados funcionais (por exemplo, produção de citocinas, matando as células-alvo). Compreender o papel funcional de TCRs é fundamental para aproveitar o poder do sistema imunológico para tratar uma variedade de doenças relacionadas imunologia (por exemplo, câncer ou de auto-imunidade).
É conveniente estudar TCRs em modelos de ratos, que pode ser feito de várias maneiras. Fazendo TCR modelos transgênicos do mouse é caro e demorado e, atualmente, existem apenas um número limitado deles disponíveis 2-4. Alternativamente, os camundongos com antígenos específicos de células T podem ser gerados pela medula óssea quimera. Este método também leva várias semanas e requer expertise 5. Transdução retroviral de TCRs em in vitro do mouse ativado células-T é um método rápido e relativamente fácil de obter células-T de especificidade desejada peptídeo-MHC. Antígeno-específica de células T podem ser gerados em uma semana e usado em todas as aplicações a jusante. Estudando transduzidas células-T também tem aplicação direta à imunoterapia humana, como a transferência adotiva de células T humanas transduzidas com antígeno específico TCRs é uma estratégia emergente para o tratamento do câncer 6.
Aqui apresentamos um protocolo para a transdução retrovirally TCRs em in vitro do mouse ativado células-T. Ambos os genes humanos e do rato TCR podem ser usados. Retrovírus portadores de genes específicos TCR são gerados e usados para infectar rato células T ativadas com anticorpos anti-CD3 e CD28-anti. Depois de na expansão in vitro, células-T transduzidas são analisados por citometria de fluxo.
Protocol
1. Prepare Construct Retroviral
- Sub-clone do T-cell receptor gene (TCR) de interesse em um vetor retroviral (Figura 1, os vetores exemplo PMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs de Cellbiolabs). A TCR α e gene da cadeia β deve estar no mesmo vetor sob o controle do mesmo promotor para garantir a expressão igual. Se o TCR de interesse é humano, os domínios humanos constante necessidade de ser substituído por domínios do mouse constante 9. Nossa observação é que TCRs comprimento total humanos não expressar de forma estável no mouse células-T.
- Prepare DNA de alta qualidade utilizando plasmídeo Maxi Kit Qiagen Prep ou produto similar. A concentração do plasmídeo deve ser em torno de 1 mg / mL.
2. Transfecção de células T e de isolamento
Dia -1 (células embalagem Plate)
- Desalojar Platinum E-(Plat-E, Cellbiolabs) células embalagem retroviral com tripsina-EDTA e neutralizar com DMEM mídia.
- Centrifugar as células a 1000 xg por 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em DMEM mídia.
- Determinar o número de células e diluir as células de 0.6x10 6 mL /. ML placa, 10 de suspensão de células em uma placa de cultura 10 milímetros poli-lisina revestido de tecido e crescer durante a noite em uma cela incubadora a 37 ° C, 5% CO 2.
Dia 0 (transfecção)
- Na manhã seguinte, examine as células em um microscópio de luz. As células devem ser aproximadamente 80% confluentes.
- Remova cuidadosamente os meios de comunicação da placa. Lave as células uma vez com PBS 1x e adicionar 10 mL pré-aquecido, fresca DMEM mídia sem penicilina-estreptomicina (Pen / Strep).
(Nota: Pen / Strep podem interferir com a transfecção) - Prepare complexo transfecção.
Preparar a mistura A e B da seguinte forma:Uma mistura: DNA plasmidial 9 mg PCL-Eco helper plasmídeo 6,3 mg OptiMEM 1,5 mL Mix B: Lipopfectime 2000 60 mL OptiMEM 1,5 mL
Incubar A e B separadamente por 5 minutos em temperatura ambiente
Mix A e B juntos suavemente e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente para formar complexos transfecção. - Gotejamento lentamente a mistura (de 3 mL total) para as células Plat-E. Agite levemente o prato para trás e para distribuir a mistura de transfecção uniformemente.
- Incubar as células a 37 ° CO C / 5 2% em uma incubadora de celular.
- Depois de 6-8 horas, substituir média com 10 mL de meio DMEM fresco (com Pen / Strep) para a produção viral.
Placa de revestimento com anticorpos
- Rato células-T precisam ser ativados antes de transdução viral. Há uma variedade maneiras para ativar as células-T. Aqui usamos placa ligado anticorpos anti-CD28 CD3e e anti-. Prepare uma mistura de anticorpos de 1 mg / mL de anti-CD3e e 2 mg / mL de anti-CD28 em PBS estéril.
- Dispense 250 L da mistura de anticorpos em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços de tecido. A placa pode ser revestido durante a noite a 4 horas ou 2 ° C a 37 ° C.
Preparação de uma única célula de suspensão de baço de rato
- Baço colheita mouse e transferência para meio RPMI.
- Coloque o baço em um coador de celular. Mash o baço com um êmbolo da seringa em uma placa de cultura 5 centímetros de tecido. Enxágüe células fora do filtro de células com PBS esterilizado.
- Centrífuga 1000 xg, 5 min.
- Elimine o sobrenadante. Ressuspender pellet celular em tampão de lise ACK (2 mL por baço). Incubar 2-3 min à temperatura ambiente. Adicionar meio RPMI até 20 mL e centrifugar 1000 xg por 5 min.
- Elimine o sobrenadante. Ressuspender celular em PBS estéril. Determinar o número de células e xg centrífuga 1000 para 5 min a 4 ° C. Proceder ao isolamento de células-T.
Isolamento e ativação de células T do mouse
- Magneticamente rótulo as células de acordo com o manual do produto (CD8 + kit de isolamento de células T de Miltenyi Biotec).
- Colocar uma coluna LS (Miltenyi Biotec), no magnetic campo. Aplicar suspensão de células marcado para a coluna. Colete de fluxo (enriquecido rato CD8 + T-cells). Lavar a coluna três vezes com 3 mL de tampão de acordo com o manual do produto e combinar com o anterior por escoamento.
- Mancha as células com anticorpos anti-CD3e e anti-CD8a e analisar por citometria de fluxo (Figura 2a). Para uma separação típica, ~ 80-10% do total de células podem ser isoladas. ~ 90% das células CD8 + são isoladas células-T.
- Centrifugar as células a 1000 xg, 5 min. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em meio RPMI com recombinante humana IL-2 (rhIL2, 20 ng / mL) em 1x10 6 / mL.
- Pouco antes de adicionar as células, remoção da solução de anticorpos da placa (previamente preparado em 2.11). Enxágüe bem cada com PBS estéril e PBS remover.
- Adicionar 1 mL da suspensão de células em cada poço. Colocar a placa a 37 ° C / 5% CO 2 em uma célula incubadora.
3. (Dia 2 e dia 3) Infecção de células T ativadas
- Após dois dias de produção de vírus, o meio na placa de células Plat-E deve tornar-se amarelo. Transfira o sobrenadante viral a um tubo de 15 mL cônico. Adicionar 10 mL de meio DMEM fresco para a placa para a produção viral mais (opcional).
- Centrífuga sobrenadante vírus em 1000 xg por 5 min para remover detritos células. Transferir cuidadosamente o sobrenadante vírus para um novo tubo. Deixe um pouco de líquido na parte inferior do tubo e não perturbe os restos de células.
- Coletar células T ativadas a partir da placa em um tubo cônico de 50 mL. Determinar o número de células. Salvar algumas células em um tubo separado para ser usado como controle (não-transduzidas) negativo. Centrifugar a 1000 xg por 5 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet celular em vírus sobrenadante a 10 6 células por 1 mL com 20 ng / mL rhIL2 e 10 mcg / ml de sulfato de protamina. Adicionar 1 mL de suspensão de células em cada poço de uma placa de 24 poços. Ressuspender as células no tubo de controle em meio RPMI na densidade das células mesmo com a mesma quantidade de sulfato de protamina e rhIL2. Adicionar as células a mesma placa.
- Embrulhe a placa com filme plástico. Centrifugar 90 minutos a 2000 xg, a 32 ° C, sem freio.
- Após a centrifugação, remover o filme plástico. Adicionar 1 mL de meio RPMI fresco com 20 ng / mL rhIL2 a cada poço. Coloque a placa de volta para a incubadora.
- (Opcional) Nível Superior expressão de TCR podem ser alcançados através da coleta do sobrenadante vírus e repetir o procedimento de infecção no dia 3.
4. Expansão das células e Avaliação da Eficiência Transdução
- Examine o transduzidas células T diariamente. Dividir as células em proporções 01:03, quando necessário, em meio RPMI rhIL2. Não deixe que a overgrow células (média fica amarelo).
- No dia 6 ou 7 dias, mancha as células com o anticorpo e tetrâmero MHC específico para o TCR para avaliar a expressão da TCR em células T de superfície. Use o un-transduzidas células-T como controle (Figura 2c).
- O transduzidas células-T estão prontos para novas aplicações a jusante.
5. Resultados representante
Muitas vezes é vantajoso para purificar de células T subconjuntos antes de transdução embora esplenócitos pode ser transduzidas sem purificação. Alta pureza de células T subconjuntos pode ser obtida usando comercial esferas magnéticas (Figura 2a).
Para avaliar o nível de expressão de TCRs sobre as células T, anticorpos específicos para TCR alfa ou beta cadeias podem ser usados. Tipicamente 30% a 80% das células podem expressar transduzidas TCR (Figura 2b), dependendo do genes TCR e os títulos de vírus. MHC específico tetrâmero para a TCR também pode ser usado para comprovar expressão funcional de TCRs (Figura 2c).
Figura 1. Exemplo de células T do gene do receptor construir sub-clonado em um vetor retroviral. Alpha de comprimento total e genes de cadeia beta estão ligadas por uma auto-linker peptídeo clivável 2A 8.
Figura 2. Exemplo de isolamento bem sucedido e transdução de células T do mouse. (A) células-T CD8 foram isoladas de esplenócitos usando CD8a + T Celular Isolation Kit (Miltenyi Biotec) e corados com anticorpos anti-CD3e e anti-CD8a. Isolado células-T CD8 foram transduzidas com R6C12 TCR específico para humanos gp100: 209 -217 peptídeo 4 e corados com anti-humano Vbeta 8 de anticorpos (b) e HLA-A2kb gp100 tetrâmero (c).
Discussion
Várias etapas são fundamentais para alcançar ótimos resultados. Plat-E linhagem de células de embalagens deve ser mantido em condição saudável. Se necessário, as células podem ser várias passagens algumas vezes em meio DMEM com 1 mg / mL puromicina, 10 mcg / ml blasticidin para evitar a perda de expressão retroviral estrutura da proteína. No dia da transfecção, as células devem ser confluentes ~ 80%. Células muito poucos ou muitos podem reduzir o título de vírus. A qualidade do vírus pode ser verificado através de estudos com linhas celulares que podem ser facilmente transduzidas. Desde TCRs exigem CD3 complexos a ser expressa na superfície das células, que usam rotineiramente 58α-/β- células de hibridoma 10 (uma linhagem celular que não expressa endógena TCR α ou β da cadeia, mas se expressa complexo CD3). Obtemos quase 100% de eficiência de transdução de células de hibridoma quando transdução de células com 1 mL do sobrenadante vírus. Finalmente, as células-T precisam ser ativados e proliferando porque retrovírus só pode infectar células em divisão ativa.
O método aqui apresentado para a produção de antígenos específicos de células T tem várias limitações. Primeiro, é difícil de alcançar eficiência de transdução de 100% para primário do mouse células-T. Uma parte das células não expressam o TCR de interesse. Segundo, o transduzidas TCR α e cadeias β pode mispair com TCRs endógena 9, que pode reduzir o nível de expressão da TCR de interesse. Além disso, o TCRs mispaired pode causar auto-imunidade in vivo 11. Finalmente, há apenas um prazo limitado a transduzidas células-T pode ser usado. Após cerca de uma semana, as células em apoptose não ser que seja re-estimulado. No entanto, as células podem tornar-se esgotado e perder funções com repetitivas re-estímulos.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (5U01CA137070) ea Sociedade Americana do Câncer (RSG-09-070-01-LIB), a Cancer Research Institute Investigator Award (MK), um American Heart Association comunhão pré-doutoramento (KM) e um Ministério espanhol da Educação e Ciência Fellowship (APG).
Gostaríamos que a agradecer ao Dr. Nicholas Restifo e Dr. Zhiya Yu (NIH / NCI) para sugestões úteis para o protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
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References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
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