Summary
Vi presenterar ett protokoll för att producera antigenspecifika mus T-celler med hjälp av retrovirus transduktion
Abstract
T-cell receptorer (TCRs) spelar en central roll i immunförsvaret. TCRs på T-cells ytor kan specifikt känner igen peptid antigener presenteras av antigenpresenterande celler (APC) 1. Detta erkännande leder till aktivering av T-celler och en serie funktionella utfall (t.ex. cytokinproduktionen, dödandet av målet celler). Att förstå den funktionella rollen för TCRs är avgörande för att utnyttja kraften i immunsystemet för att behandla en rad olika immunologiska sjukdomar (t.ex. cancer eller autoimmunitet).
Det är bekvämt att studera TCRs i musmodeller, som kan utföras på flera sätt. Göra TCR transgena musmodeller är kostsamt och tidskrävande och för närvarande finns endast ett begränsat antal av dem tillgängliga 2-4. Alternativt antigen T-celler möss med kan genereras av benmärg chimär. Denna metod tar också flera veckor och kräver sakkunskap 5. Retroviral transduktion av TCRs i in vitro-aktiverade mus T-celler är en snabb och relativt enkel metod för att få T-celler av önskad peptid-MHC specificitet. Antigen-specifika T-celler kan genereras i en vecka och användas i alla tillämpningar i efterföljande led. Studera transduced T-celler har också direkta tillämpningen för människors immunterapi, som adoptiv transfer av humana T-celler transduced med antigen-specifika TCRs är en framväxande strategi för cancerbehandling 6.
Här presenterar vi ett protokoll till retrovirally transduce TCRs i in vitro-aktiverade mus T-celler. Både mänskliga och mus TCR gener kan användas. Retrovirus bär specifika TCR gener genereras och används för att infektera mus T-celler aktiveras med anti-CD3 och anti-CD28 antikroppar. Efter in vitro-expansion, transduced T-cellerna analyseras med flödescytometri.
Protocol
1. Förbered retroviral Konstruera
- Sub-klon av T-cells receptor (TCR)-genen av intresse i ett retrovirus vektor (Figur 1, exempel vektorer pMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs från Cellbiolabs). TCR α-och β-kedjan gen ska vara på samma vektor under kontroll av samma promotor för att garantera lika uttryck. Om TCR av intresse är mänskliga, det mänskliga konstanta domäner måste ersättas med musen konstant domäner 9. Vår iakttagelse är att fulla längd mänskliga TCRs inte stabilt Express på mus T-celler.
- Förbered hög kvalitet plasmid-DNA med Qiagen Maxi Prep Kit eller liknande produkt. Koncentrationen av plasmiden bör vara ca 1 mikrogram / mikroliter.
2. Transfektion och T-cells Isolation
Dag -1 (tavla förpackning celler)
- Få bort Platinum-E (Plat-E, Cellbiolabs) retrovirus förpackning celler med trypsin-EDTA och neutralisera med DMEM medier.
- Centrifugera cellerna vid 1000 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i DMEM medier.
- Bestäm mobilnummer och späd cellerna på 0.6x10 6 / mL. Plate 10 ml cellsuspension i en 10mm poly-lysin belagd vävnadsodling plåt och växa över natten i en cell inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2.
Dag 0 (Transfektion)
- Nästa morgon undersöka cellerna under ett ljusmikroskop. Cellerna bör vara ca 80% konfluenta.
- Ta försiktigt bort media från plattan. Tvätta cellerna gång med 1x PBS och tillsätt 10 ml förvärms, färsk DMEM media utan Penicillin-streptomycin (Pen / Strep).
(Obs: Penna / Strep kan störa transfektion) - Förbered transfektion komplex.
Förbered blanda A och B enligt följande:Mix A: Plasmid DNA 9 mikrogram PCL-Eco helper plasmid 6,3 mikrogram OptiMEM 1,5 ml Mix B: Lipopfectime 2000 60 mikroliter OptiMEM 1,5 ml
Inkubera A och B separat för 5 minuter vid rumstemperatur
Blanda A och B tillsammans försiktigt och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur bilda transfektion komplex. - Sakta droppa blandningen (totalt 3 ml) i Plat-E celler. Skaka plattan fram och tillbaka för att fördela transfektion blandningen jämnt.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C / 5% CO 2 i en cell kuvös.
- Efter 6-8 timmar, byt medium med 10 ml rent DMEM medium (med penna / STREP) för viral produktion.
Coat tallrik med antikroppar
- Mus T-celler måste aktiveras innan viral transduktion. Det finns en mängd sätt att aktivera T-celler. Här använder vi platta bundna mot CD3e och anti-CD28 antikroppar. Förbered en antikropp blandning av 1 mikrogram / ml av anti-CD3e och 2 mikrogram / ml av anti-CD28 i sterila PBS.
- Tillsätt 250 mikroliter av antikroppen blandningen till varje brunn på en 24-väl vävnadskultur plattan. Plåten kan beläggas över natten vid 4 ° C eller 2 timmar vid 37 ° C.
Beredning av encelliga avstängning från mus mjälte
- Harvest mus mjälte och transfer till RPMI medium.
- Placera mjälte i en cell sil. Mosa mjälte med en spruta kolven i en 5 cm vävnadskultur plattan. Skölj celler utanför cellen silen med sterila PBS.
- Centrifug 1000 xg, 5 min.
- Kassera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i ACK lyserings buffert (2 ml per mjälte). Inkubera 2 till 3 minuter i rumstemperatur. Lägg RPMI medelstora upp till 20 ml och centrifugera 1000 xg under 5 minuter.
- Kassera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i sterila PBS. Bestäm mobilnummer och centrifugera 1000 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Fortsätt till isolering av T-cell.
Isolering och aktivering av mus-T-celler
- Magnetiskt märka celler beroende på vilken produkt manuella (CD8 + T-celler isolering kit från Miltenyi Biotec).
- Placera en LS kolumn (Miltenyi Biotec) i Magnetic fältet. Applicera märkt cellsuspension på kolonnen. Samla genomströmning (berikad mus CD8 + T-celler). Tvätta kolonnen tre gånger med 3 mL buffert enligt produktens manual och kombinera med tidigare flow-through.
- Färga cellerna med anti-CD3e och anti-CD8a antikroppar och analysera med flödescytometri (figur 2a). För en typisk separation, kan ~ 8-10% av det totala celler isoleras. ~ 90% av isolerade celler CD8 + T-celler.
- Centrifugera cellerna vid 1000 xg, 5 min. Kassera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i RPMI medium med rekombinant humant IL-2 (rhIL2, 20 ng / ml) på 1x10 6 / mL.
- Strax innan du lägger till celler, ta bort antikroppar lösning från plattan (beredd tidigare 2,11). Skölj varje brunn med sterilt PBS och ta PBS.
- Tillsätt 1 mL av cellsuspensionen i varje brunn. Sätt plattan vid 37 ° C / 5% CO 2 i en cell kuvös.
3. (Dag 2 och dag 3) Infektion av aktiverade T-celler
- Efter 2 dagar av virus produktionen bör mediet i Plat-E-cell plattan blir gul. Överföring virus supernatanten till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt 10 ml av färsk DMEM medium till plattan för vidare virus-produktion (tillval).
- Centrifugera virus supernatanten vid 1000 xg under 5 minuter för att avlägsna celler skräp. Försiktigt överföra virus supernatanten till ett nytt rör. Lämna lite vätska i botten av röret och inte stör cellerna skräp.
- Samla aktiverade T-celler från plattan i ett 50 ml koniskt rör. Bestäm mobilnummer. Spara några celler i ett separat rör som ska användas som negativa (FN-transduced) kontroll. Centrifugera vid 1000 xg under 5 minuter och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i virus supernatanten vid 10 6 celler per 1 ml med 20 ng / ml rhIL2 och 10 mikrogram / ml protaminsulfat. Tillsätt 1 ml cellsuspension i varje brunn på en 24 brunnar. Resuspendera cellerna i kontroll röret i RPMI medium vid samma cell densitet med samma mängd rhIL2 och protaminsulfat. Lägg till cellerna på samma tallrik.
- Linda plattan med plastfilm. Centrifugera 90 minuter vid 2000 xgi, vid 32 ° C utan broms.
- Efter centrifugering, ta bort plastfilmen. Tillsätt 1 ml färsk RPMI medium med 20 ng / ml rhIL2 i varje brunn. Sätt plattan tillbaka till inkubatorn.
- (Valfritt) Högre uttryck nivå TCR kan uppnås genom att samla in viruset supernatanten och upprepa infektionen proceduren på dag 3.
4. Utbyggnad av celler och utvärdering av Transduction Effektivitet
- Undersök transduced T-celler dagligen. Dela cellerna vid 01:03 nyckeltal när det behövs i RPMI medelstora rhIL2. Låt inte cellerna växa över (medium blir gul).
- I dag 6 eller dag 7, färga cellerna med antikroppar och MHC tetramer specifika för TCR att utvärdera uttryck av TCR på T-cellernas yta. Använd FN-transduced T-celler som kontroll (Figur 2c).
- Den transduced T-celler är redo för vidare applikationer.
5. Representativa resultat
Det är ofta fördelaktigt att rena T-cells delmängder innan transduktion även splenocytes kan transduced utan rening. Hög renhet T-cells delmängder kan erhållas med kommersiella magnetiska kulor (Figur 2a).
För att utvärdera uttrycket nivå TCRs på T-cellerna kan antikroppar specifika för TCR alfa-eller beta kedjor användas. Vanligtvis 30% till 80% av cellerna kan uttrycka transduced TCR (figur 2b) beroende på TCR gener och titer virus. MHC tetramer specifikt för TCR kan även användas för att ytterligare kontrollera funktionella uttryck för TCRs (Figur 2c).
Figur 1. Exempel på T-cell receptor genen bygga sub-klonad i ett retrovirus vektor. Hel längd alfa och beta gener kedjan är förbundna genom ett själv-cleavable 2A peptid länkare 8.
Figur 2. Exempel på framgångsrika isolering och transduktion av mus-T-celler. (A) CD8 T-celler var isolerade från splenocytes använda CD8a + T Kit Cell Isolering (Miltenyi Biotec) och färgas med anti-CD3e och anti-CD8a antikroppar. Isolerad CD8 T-celler var transduced med R6C12 TCR specifika för mänskliga gp100: 209 -217 4 peptid och färgas med anti-humana Vbeta 8 antikropp (b) och HLA-A2kb gp100 tetramer (c).
Discussion
Flera steg är avgörande för att uppnå optimala resultat. Plat-E förpackningar cellinje bör förvaras i friskt tillstånd. Vid behov kan cellerna bli passerats ett par gånger i DMEM medium med 1 mikrogram / ml puromycin, 10 mikrogram / ml blasticidin att förhindra förlust av retrovirus struktur proteinuttryck. På dagen för transfektion, bör de celler vara ~ 80% konfluenta. För få eller för många celler kan minska viruset titer. Viruset kvalitet kan kontrolleras genom provning på cellinjer som lätt kan transduced. Sedan TCRs kräver CD3 komplex skall uttryckas på cellytan, vi använder rutinmässigt 58α-/β- Hybridomteknik celler 10 (en cellinje som inte uttrycker endogena TCR α-eller β-kedjan, men uttrycker CD3 komplexet). Vi får nästan 100 verkningsgrad% transduktion av Hybridomteknik celler när transducing celler med 1 ml av virus supernatant. Slutligen T-celler måste aktiveras och prolifererande eftersom retrovirus kan bara infektera aktivt delande celler.
Den metod som presenteras här för att producera antigen-specifika T-celler har flera begränsningar. Det första är det svårt att nå 100% transduktion effektivitet för primär mus T-celler. En del av de celler uttrycker inte TCR av intresse. För det andra transduced TCR α och β kedjorna kan mispair med endogen TCRs 9, vilket kan minska uttryck nivån på TCR av intresse. Dessutom kan de mispaired TCRs orsakar autoimmunitet in vivo 11. Slutligen finns det bara en begränsad tid på transduced T-celler kan användas. Efter ca en vecka, de celler genomgå apoptos om på nytt stimuleras. Dock kan cellerna bli utmattad och förlora funktioner med repetitiva nytt stimuli.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (5U01CA137070) och American Cancer Society (RSG-09-070-01-lib), en Cancer Research Institute Investigator Award (MK), en American Heart Association doktorander gemenskap (KM) och ett spanska ministeriet för utbildning och vetenskap Fellowship (APG).
Vi vill att tacka Dr Nicholas Restifo och Dr Zhiya Yu (NIH / GNI) för hjälp förslag till protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | |
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | |
| Recombinant human IL2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| Anti-CD3e antibody | BD Biosciences | 553057 | |
| Anti-CD28 antibody | BD Biosciences | 553294 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Biosciences | 356469 | |
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | |
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | |
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | |
| FBS | Hyclone | SH3008803 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | |
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | |
| β- Mercaph–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
Media: DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid). DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep). RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaph–thanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate). |
|||
References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells 'see' antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
