Summary
Vi presenterar en metod för att förbereda organotypic skivor mitt i dräktigheten musembryon för odling och tidsförlopp avbildning av perifera nerver utväxt.
Abstract
För många ändamål är odling av musembryon ex vivo som organotypic skivor önskvärt. Till exempel använder vi en transgen mus linje (tauGFP) där förbättrad version av det grönt fluorescerande protein (EGFP) är enbart uttrycks i alla nervceller i att utveckla centrala och perifera nervsystemet 1, vilket gör det möjligt att både filma innervation av den forelimb och att manipulera denna process med farmakologiska och genetiska tekniker 2. Den mest kritiska parametern i den framgångsrika odling av sådan skiva kulturer är den metod som skivorna är beredda. Efter omfattande tester av en mängd olika metoder, har vi funnit att en vibratome är den bästa möjliga enheten till skiva embryon så att de rutinmässigt resultera i en kultur som visar lönsamheten under en period av flera dagar, och viktigast, utvecklas i en ålder -specifika sätt. För mitt i dräktigheten embryon omfattar detta normalt utväxt av spinal nerver från ryggmärgen och dorsalrotsganglier till sina mål i periferin och en korrekt bestämning av skelett-och muskelvävnad.
I detta arbete presenterar vi en metod för behandling av hela embryon av embryonala dag (E) E10 till E12 till 300 till 400 mikrometer skivor för odling i en vanlig vävnadsodling inkubator, som kan studeras i upp till två dagar efter skiva beredning. Avgörande för framgången med denna metod är att använda en vibratome att skära varje agaros-inbäddade embryo. Detta följs av odlingen av de skivor på Millicell insatser kultur membran placeras på en liten volym av medium, vilket resulterade i ett gränssnitt kultur teknik. En kull med ett genomsnitt på 7 embryon ger rutinmässigt minst 14 skivor (2-3 skivor av forelimb regionen per embryot), som varierar något beroende på ålder embryon samt tjockleken på skivorna. Cirka 80% av den odlade skivor visar nerv utväxt, som kan mätas througout den odling period 2. Representativa resultat genom att använda tauGFP musen linjen demonstreras.
Protocol
Del 1: Förberedelser för skivning och odling.
- Förbered 10-cm plattor vävnadsodling med skivning medium (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fetalt bovint serum, 0,5% glukos, 1 mM glutamin, 2,5 mm HEPES, pH 7,3) och 3-cm Millicell-CM 0.4-ìm kultur membran skär och hålla i inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Värm upp 4% låg smältpunkt agaros i PBS i mikrovågsugnen och hålla den på värmeplattan så att den stannar vid ca 37 ° C.
- Fyll 10-cm bakteriologiska petriskålar med PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mm Na 2 HPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4) och lägg på is.
- Ställ in mikrotom kylanordning eller se till att bufferten facket och kylelement lagras i frysen i förväg kyla den.
Del 2: Embryo inbäddning.
- Dissekera embryon från livmodern och granska dem med en inverterad fluorescerande mikroskop för att kontrollera GFP uttryck.
- Placera embryon på en inverterad 10-cm petriskål och orientera dem med Whatman pappersremsor för att ta bort alltför PBS.
- Applicera agarosen på embryo att fixa det i detta läge. Låt agaros stelna.
- Begränsa området kring embryot genom att skära med ett rakblad.
- Rotera inbäddade embryot på dess andra sida.
- Applicera ytterligare agarosen om embryonal vävnad för att säkerställa att embryot är helt inbäddad.
- Förbered agaros block med rena kanter och montera på vibratome chuck med Loctite 406, ett speciellt lim som liknar "Krazy Glue".
Del 3: Skivning förfarande.
- Ställ in precooled buffert facket och kylelementet.
- Sätt chucken med limmade vävnad och lägga 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 +-fri HBSS, 10 mm HEPES buffert pH 7,3, 500 U / ml penicillin / streptomycin) tills omfattas.
- Sätt in och fixa en precleaned (70% etanol) mikrotomen blad.
- Förbered 350 till 450 ìm skivor och överföra dem med kortare glas Pasteur pipetter i plattor vävnadsodling hålls på is.
- Med hjälp av en pincett, försiktigt bort agaros från varje skiva och överföra till Millicell kultur membran. Om 4 skivor kan odlas på ett membran i en 10-cm vävnadsodling tallrik fylld med 6 ml odlingsmedium.
- Inkubera skivor vid 37 ° C och 5% CO 2 (Kultur medium: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fetalt bovint serum, 0,5% glukos, 1mm glutamin, 2,5 mm HEPES, pH 7,3). Om man utför tidsförlopp imaging serie man ska hålla volymen av medium konstant. Vid tidsinställda imaging serien för en kort tid räcker det att lämna mediet som den är. För längre kultur perioder förändringar efter 12-20 timmar rekommenderas.
Del 4: Imaging spinal nerv utväxt i mikroskop.
- Bild spinal nerver placera en 10-cm tallrik vävnadsodling, innehåller Millicell kultur membran med skivor, enligt en upprätt fluorescerande mikroskop.
- Märk orientering Millicell kultur membran på mikroskop scenen att placera rätt sätt vid nästa avbildning tidpunkt.
- Bild spinal nerv utväxt med 4x (numerisk apertur [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) eller 20x (NA 0,5) mål.
Figur 1 visar en avbildning serie som skildrar spinal nerv utväxt under 20 timmar av kultur med 4x och 10x mål.
Figur 1 Imaging serie av spinal nerv utväxt på ett tvärgående bit av en homozygot tauGPF embryo. * = Motoriska nervceller i den ventrala ryggmärgen, pil = DRG. Den dorsala (D)-ventrala (V) axel segmentet anges. Scalebars: 200 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I en omfattande jämförelse av metoder för att förbereda embryonala bit kultur mitt i dräktigheten musembryon (E10 - E12), har vi konstaterat att en vibratome producerar utan tvekan den mest tillförlitliga resultat med hänsyn till både den totala lönsamheten för kulturer och reproducerbarhet nerven utväxt mönster. Däremot beredd skivor med hjälp av en McIlwain vävnad chopper 3 visade sig vara helt inviable. Vi arbetar ursprungligen en giljotin metod 4, där en hel kull av embryon kan beredas samtidigt genom skärning med volfram trådar lindade seriellt runt en skärande galler för att producera 400-ìm avsnitt 1. Även om denna teknik hade fördelen av hastighet av förberedelser, gav den högst en livskraftig avsnitt per embryo och visade en stor mängd variationer i utväxt parametrar. Av dessa skäl anser vi att en vibratome-baserad metod är överlägsen valet trots längre tid i förberedelser. Även om denna lösning med nödvändighet kräver en vibratome, resultaten är vida överlägsen vad som har uppnåtts genom andra "low-tech" metoder, och därmed motiverar investeringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna erkänner den ursprungliga källan för idén att utföra skiva kultur på musembryon 5. Vi vill tacka för Joachim Kirsch för generösa vetenskapligt stöd och Anna Degen för att agera som vår Gofer under filmningen. Detta arbete har finansierats av det tyska Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) och universitetet i Heidelberg (Excellence Cluster cellulära nät).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS 10x | GIBCO, by Life Technologies | 14180 | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | various | |
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Whatmann paper | Whatman, GE Healthcare | 3030917 | |
| Shortened firepolished pipettes | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41966 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | |
| Pen Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650 V | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| analySIS | Soft Imaging System | ||
| Millicell-CM inserts | EMD Millipore | PICMORG 50 | |
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | |
| LOCTITE 406 | Henkel Corp | 142580 | |
| Razor blades | Thermo Fisher Scientific, Inc. | none | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| HEPES | Carl Roth Gmbh | 9105.2 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| x4 objective | Olympus Corporation | PL series | |
| x10 objective | Olympus Corporation | UPLFL –PH series | |
| Filter | Olympus Corporation | U-MNIBA2 | |
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | |
| Equipment for heated chamber | Leica Microsystems | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
References
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W.
