Summary
We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.
Abstract
Voor vele doeleinden, de teelt van muizenembryo's ex vivo als organotypische plakken is wenselijk. Bijvoorbeeld, gebruiken we een transgene muis lijn (tauGFP), waarin de uitgebreide versie van het groen fluorescerend eiwit (EGFP) uitsluitend wordt uitgedrukt in alle neuronen van de ontwikkelingslanden centraal en perifeer zenuwstelsel 1, waardoor de mogelijkheid om zowel film als de innervatie van de voorpoot en om dit proces te manipuleren met farmacologische en genetische technieken 2. De meest kritische parameter in de succesvolle teelt van dergelijke slice culturen is de methode waarmee de schijfjes worden bereid. Na uitgebreide testen van een verscheidenheid aan methoden, we hebben ontdekt dat een vibratome is de best mogelijke apparaat om de embryo's zodanig dat ze routinematig resulteren in een cultuur die levensvatbaarheid over een periode van enkele dagen, en vooral laat zien slice, ontwikkelt zich in een tijdperk -specifieke manier. Voor mid-zwangerschap embryo's omvat dit de normale uitgroei van de spinale zenuwen uit het ruggenmerg en de achterwortelganglia om hun doelen in de periferie en de juiste bepaling van de skelet-en spierweefsel.
In dit werk, presenteren we een methode voor het verwerken van hele embryo's van embryonale dag (E) E10 tot E12 in 300 tot 400 micrometer plakjes voor de teelt in een standaard weefselkweek incubator, die kunnen worden bestudeerd voor tot twee dagen na de slice voorbereiding. Cruciaal voor het succes van deze aanpak is het gebruik van een vibratome aan elk agarose-embedded embryo slice. Dit wordt gevolgd door de teelt van de schijfjes op Millicell cultuur membraan inserts geplaatst op een klein volume van het medium, wat resulteert in een interface cultuur techniek. Een nest met een gemiddelde van 7 embryo's produceert gewoonlijk minstens 14 sneetjes (2-3 plakjes van de voorpoot regio per embryo), die een beetje varieert vanwege de ouderdom van de embryo's en aan de dikte van de plakken. Ongeveer 80% van de gekweekte plakjes tonen zenuw uitgroei, die kan worden gemeten througout het kweken periode 2. Representatieve resultaten met behulp van de muis tauGFP lijn worden gedemonstreerd.
Protocol
Deel 1: Voorbereiding voor het snijden en het kweken.
- Bereid 10-cm weefselkweek platen met het snijden van medium (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% foetaal runderserum, 0,5% glucose, 1 mM glutamine, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) en 3-cm Millicell-CM 0.4-um cultuur membraan inserts en in de broedstoof bij 37 ° C te houden en 5% CO 2.
- Verwarm 4% een laag smeltpunt agarose in PBS in de magnetron en houdt het bij verhitting plaat, zodat het blijft op ongeveer 37 ° C.
- Vul 10-cm bacteriologische Petrischalen met PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4) en leg ze op ijs.
- Stel microtoom koeling of ervoor te zorgen dat de buffer lade en koelelementen worden opgeslagen in de vriezer om pre-cool is.
Deel 2: Embryo inbedding.
- Ontleden embryo uit de baarmoeder en bekijk je ze met een omgekeerde fluorescentie microscoop om te controleren of GFP expressie.
- Plaats embryo's op een omgekeerde 10-cm petrischaal en oriënteren ze met behulp van Whatman papier strips te veel PBS te verwijderen.
- Van toepassing zijn op de embryo agarose op te lossen in deze positie. Laat agarose stollen.
- Beperk de omgeving van het embryo door te snijden met een scheermesje.
- Draai de embedded embryo op zijn andere kant.
- Toe te passen extra agarose op embryonaal weefsel om ervoor te zorgen dat het embryo volledig is ingebed.
- Bereid agarose blok met schone randen en monteren op vibratome chuck met Loctite 406, een speciale lijm gelijkaardig aan "Krazy Glue".
Deel 3: Fineersnijmachine procedure.
- Stel de voorgekoeld buffer lade en het koelelement.
- Plaats de boorkop met de gelijmde weefsel en voeg 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 +-vrij HBSS, 10 mM HEPES buffer pH 7,3, 500 U / ml penicilline / streptomycine) tot gedekt.
- Invoegen en vast een voorgereinigde (70% ethanol) microtoom mes.
- Bereid 350 tot 450 micrometer plakjes en breng ze met behulp van verkorte glas pasteurpipetten in weefselkweek platen bewaard op ijs.
- Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig agarose uit elke plak en overdracht van cultuur membranen Millicell. Ongeveer 4 plakjes kunnen worden gekweekt op een membraan in een 10-cm weefselkweek plaat gevuld met 6 ml kweekmedium.
- Incubeer plakken bij 37 ° C en 5% CO 2 (Cultuur medium: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% foetaal runderserum, 0,5% glucose, 1 mM glutamine, 2,5 mM HEPES, pH 7,3). Als men voert time-lapse imaging serie een moet houden van het volume van het medium constant. In het geval van getimede imaging-serie voor een korte tijd is het voldoende om het medium te laten zoals het is. Voor langere periodes cultuur verandert na 12-20 uur wordt aanbevolen.
Deel 4: Imaging spinale zenuw uitgroei aan de microscoop.
- Afbeelding spinale zenuwen het plaatsen van een 10-cm weefselkweek plaat, met daarin Millicell cultuur membranen met plakjes, onder een rechte fluorescentiemicroscoop.
- Het etiket van de oriëntatie van Millicell cultuur membranen op microscoop podium om de juiste positie in de komende beeldvorming tijdstip.
- Afbeelding spinale zenuw uitgroei met 4x (numerieke lensopening [NA] 0,1), 10x (NA 0.3) of 20x (NA 0,5) doelstellingen.
Figuur 1 toont een imaging-serie afbeeldingen van de spinale zenuw uitgroei tijdens de 20 uur van de cultuur met 4x en 10x doelstellingen.
Figuur 1 Imaging serie van spinale zenuw uitgroei in een transversale slice van een homozygote tauGPF embryo. * = Motorische neuronen van de ventrale ruggenmerg, pijl = DRG. De dorsale (D)-buik (V) as van het schijfje wordt aangegeven. Scalebars: 200 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In een uitgebreide vergelijking van methoden voor het embryonale slice culturen van mid-dracht muis embryo's (E10 - E12) voor te bereiden, hebben we vastgesteld dat een vibratome produceert zonder twijfel de meest betrouwbare resultaten met betrekking tot zowel de algemene leefbaarheid van de culturen en de reproduceerbaarheid van de zenuw uitgroei patronen. In tegenstelling, plakjes bereid met behulp van een tissue McIlwain chopper 3 bleek te zijn volledig inviable. We oorspronkelijk in dienst een guillotine methode 4, waarin een heel nest van embryo's tegelijkertijd zou kunnen worden voorbereid door het snijden met wolfraam draden in serie rond een snij-rooster tot 400-um secties een te produceren. Hoewel deze techniek het voordeel van de snelheid van de voorbereiding, het leverde hooguit een levensvatbare embryo per sectie en toonden een grote hoeveelheid variabiliteit in uitgroei parameters. Om deze redenen, voelen we dat een vibratome-gebaseerde methode is de superieure keuze, ondanks de langere tijd in voorbereiding. Hoewel deze oplossing door de noodzakelijkheid vereist een vibratome, de resultaten zijn veel beter wat er is bereikt door andere "low-tech"-benaderingen, en dus rechtvaardigt de investering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de originele bron voor de idee om slice cultuur uit te voeren op muizenembryo's 5. We willen graag Joachim Kirsch erkennen voor genereuze wetenschappelijke ondersteuning en Anna Degen voor het fungeren als onze gofer tijdens het filmen. Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) en de Universiteit van Heidelberg (Excellence Cluster mobiele netwerken).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS 10x | GIBCO, by Life Technologies | 14180 | |
| Dissection tools | Fine Science Tools | various | |
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Whatmann paper | Whatman, GE Healthcare | 3030917 | |
| Shortened firepolished pipettes | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41966 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | |
| Pen Strep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-glutamine 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Vibratome | Microm International | HM 650 V | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
| analySIS | Soft Imaging System | ||
| Millicell-CM inserts | EMD Millipore | PICMORG 50 | |
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | |
| LOCTITE 406 | Henkel Corp | 142580 | |
| Razor blades | Thermo Fisher Scientific, Inc. | none | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| HEPES | Carl Roth Gmbh | 9105.2 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| x4 objective | Olympus Corporation | PL series | |
| x10 objective | Olympus Corporation | UPLFL –PH series | |
| Filter | Olympus Corporation | U-MNIBA2 | |
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | |
| Equipment for heated chamber | Leica Microsystems | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
References
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).
