Protocole pour des essais de l'ARNi dans les moustiques adultes (A. gambiae)

Summary

Inverse des approches génétiques se sont avérées extrêmement utiles pour déterminer quels gènes de résistance sous-tendent à des agents pathogènes vecteurs de moustiques. Ce protocole vidéo illustre une méthode utilisée par le laboratoire Dimopoulos à injecter dans les ARNdb Anopheles gambiae moustiques, qui abritent le parasite du paludisme. La technique de manipulation de l'installation d'injection et injection ARNdb dans le thorax est illustré.

Abstract

Inverse des approches génétiques se sont avérées extrêmement utiles pour déterminer quels gènes de résistance sous-tendent à des agents pathogènes vecteurs de moustiques. Ce protocole vidéo illustre une méthode utilisée par le laboratoire Dimopoulos à injecter dans les ARNdb Anopheles gambiae moustiques, qui abritent le parasite du paludisme. La technique de manipulation de l'installation d'injection et injection ARNdb dans le thorax est illustré.

Protocol

Silençage génique médiée par ARNi chez les moustiques nécessite une préparation préalable et la purification de dsRNA spécifiques qui ciblent le gène d'intérêt. Pour la synthèse ARNdb, nous recommandons le kit Megascript Ambion qui rend l'utilisation d'un ARN polymérase T7 médié réaction de transcription in vitro. Pour la purification ARNdb, nous recommandons le kit Qiagen RNeasy. Des échantillons d'ARNdb doivent être quantifiées et ajusté à 3 pg / pl dans l'eau. D'autres matériaux que vous devrez inclure: pointe fine pince, lame de verre, des aiguilles de verre microcapillaire, microinjecteur (nous utilisons Drummond Nanoject II), un microscope optique monté au-dessus d'un bloc froid, un verre recouvert boîte de Pétri, serviettes en papier et un seau de glace . Vous aurez également besoin d'un moyen pour recueillir les moustiques et des récipients appropriés pour eux avec une source de nourriture, comme boule de coton imbibé de 10% de saccharose.

1. Rassemblez vos moustiques. Utiliser un aspirateur à piles, de recueillir les moustiques vous désirez injecter. Branchez la buse avec une serviette en papier ou en coton donc pas de moustiques peuvent s'échapper et retirez le réservoir. Comme les températures froides anesthésier les moustiques, enterrer le réservoir dans un seau de glace et attendre 5-10 minutes pour les moustiques pour arrêter le déplacement. Anesthésie peut également être réalisé en plaçant le réservoir dans une chambre froide ou un réfrigérateur ou en utilisant du CO _2. Au cours de ces 5-10 minutes, passez à l'étape suivante.
   
   
2. Préparez votre espace de travail. Définissez un bloc de surface plane à froid à 2 ° C et placer une lame de verre sur elle. C'est là que les moustiques se reposera comme vous les injecter. Fixer une aiguille de verre sur le microinjecteur et utiliser vos pinces pour briser la pointe de l'aiguille à la largeur désirée. Il est important que la largeur est suffisamment grande pour permettre assez de place pour le liquide de couler à travers à un taux raisonnable, mais est suffisamment étroit pour infliger une blessure minime pendant l'injection. Une bonne pointe de l'aiguille sera assez étroit pour se plier légèrement, mais pas casser. Réglez votre matériel d'injection au volume de sortie désirée (pour l'ARNi, nous utilisons 69 NL). Immergez le bout de votre aiguille dans votre échantillon et attirer votre échantillon de liquide dans l'aiguille en utilisant les instructions du fabricant. L'échantillon liquide peut être une solution ARNdb, la suspension bactérienne, ou d'autres, le processus d'injection est la même pour tous. Intégrer un plat en verre de Pétri dans le seau à glace afin que le fond du plat est complètement contactant la glace. C'est là que vous allez mettre les moustiques jusqu'à ce que vous êtes prêt à les injecter.
   
   
3. Préparez votre moustiques. Transférer 50-100 moustiques à partir du réservoir au plat en verre de Pétri. Utilisez votre pince à leur mince à une seule couche, en veillant à la plupart ont contact avec le fond du plat froid pour les maintenir sous anesthésie. Couvrir ces moustiques avec le plat couvert lorsqu'il n'est pas utilisé. Retour du réservoir vers le seau à glace pour garder le reste des moustiques anesthésiés.
   
   
4. Mont moustiques sur le bloc à froid. Utilisez votre pince à pointe fine pour transférer les moustiques un à la fois de l'antenne de la lame de verre montée sur le bloc de froid sous le microscope optique. Manipuler délicatement les moustiques, de préférence par les jambes. Line up autant que 30 moustiques côte-à-côte sur la diapositive, faire en sorte que vous pouvez obtenir à chacun avec le microinjecteur et s'assurer chacun fait contact avec la lame froide. Assurez-vous que les moustiques sont alignés ordonnée afin que, comme vous allez le long vous savez qui ont et qui n'ont pas été injecté. Laisser les moustiques d'autres couverts dans le plat refroidi Petri.
   
   
5. Injectez votre premier groupe de moustiques. Tenez votre pointe fine pince à pointe dans une main et tenir le microinjecteur dans l'autre main comme un crayon. Utilisez la pince pour déplacer les moustiques que vous avez besoin (les manipuler par les jambes pour éviter les blessures) et de garder le moustique régulière comme vous l'injecter. Cela fonctionne mieux si vous utilisez la pince pour soutenir d'un côté du moustique comme vous vous injectez de l'autre côté. Insérez soigneusement juste la pointe de l'aiguille dans le thorax du moustique. Il est préférable d'injecter dans une partie tendue encore mince de la cuticule pour minimiser les blessures. Aussi, éviter d'injecter trop profondément, vous voulez juste la pointe à l'intérieur du thorax; profond injections causent des blessures plus grande qui sera compromis la survie. Une fois que l'aiguille est en position, appuyez et relâchez la pédale de l'appareil microinjecteur qui livrera votre pré-régler le volume d'ARNdb. Attendez une seconde ou deux et retirez l'aiguille du moustique. Si une goutte de liquide apparaît à l'extérieur du site de la plaie, attendre quelques secondes pour qu'il soit absorbé dans la plaie. Si ce n'est pas absorber en quelques secondes, jeter ce moustique et essayez de nouveau. Poursuivre le processus d'injection pour tous les moustiques sur votre lame de verre.
   
   
6. Stockez vos moustiques. Lorsque vous avez terminé, placez votre moustiques injecté à l'intérieur des conteneurs étiquetés (nous préférons une pinte tasses de carton paraffiné couverts parmailles des filets et sécurisé avec des bandes de caoutchouc et d'un couvercle en carton).
   
   
7. Continuer les injections jusqu'à la fin. Continuer à placer les moustiques sur la diapositive, injecter et le transfert à des coupes jusqu'à ce que vous avez la taille de l'échantillon que vous désirez. Compte pour quelques morts-débutants auront beaucoup de moustiques meurent d'un traumatisme de l'injection. Cela permettra d'améliorer la pratique jusqu'à ce que presque 100% de votre moustiques survivent injection.
   
   
8. Lorsque vous avez terminé, placez un plié, une serviette en papier humide sur la tasse avec une source de nourriture et couvrir les tasses avec quelque chose à retenir l'humidité, comme une pellicule de plastique ou un couvercle en plastique de Pétri. Injecté moustiques sont sujettes au dessèchement de sorte que l'humidité fournie par la serviette humide et conservés par le plastique permet d'éviter cela.
   
   
9. Placez votre moustiques dans une chambre à environnement contrôlé pour l'incubation.

Remarque: l'efficacité du silençage génique est très variable et dépend d'un certain nombre de facteurs, dont la transcription et des protéines turn-over des taux, et l'efficacité d'absorption ARNdb par les cellules et les organes. Nous avons trouvé que l'inhibition commence dès le 1er jour après l'injection et peut durer jusqu'à 6 jours après l'injection. Utiliser des méthodes de détection et de la transcription des protéines telles que la PCR quantitative et Western blot pour valider taire.

Remarque: Il existe plusieurs variations sur plusieurs étapes de l'injection de moustiques et de l'ARNi à médiation technique de silençage génique. Certaines variations sont décrites par: Boisson, et al (2006) et Blandin et al (2002)...

Discussion

Efficacité de l'inactivation du gène est très variable et dépend d'un certain nombre de facteurs, dont la transcription et des protéines turn-over des taux, et l'efficacité d'absorption ARNdb par les cellules et les organes. Nous avons trouvé que l'inhibition commence dès le 1er jour après l'injection et peut durer jusqu'à 6 jours après l'injection. Utiliser des méthodes de détection et de la transcription des protéines telles que la PCR quantitative et Western blot pour valider taire.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond Scientific	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos