Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.
Abstract
Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.
Protocol
RNAi-vermittelten Gen-Silencing in Mücken, bedarf der vorherigen Herstellung und Reinigung von spezifischen dsRNAs, dass das Gen von Interesse Ziel. Für dsRNA-Synthese, empfehlen wir die Ambion Megascript Kit, Verwendung eines T7-RNA-Polymerase-vermittelte in vitro Transkriptions-Reaktion macht. Für dsRNA Reinigung empfehlen wir die Qiagen RNeasy-Kit. Proben von dsRNA zu quantifizieren und angepasst werden, um 3 ug / ul in Wasser. Andere Materialien, die Sie benötigen sind: spitzen Pinzette, Objektträger a…
Discussion
Effizienz der Gen-Silencing ist sehr variabel und hängt von einer Reihe von Faktoren, einschließlich Transkript und Protein turn-over-Raten und dsRNA Aufnahme Effizienz von Zellen und Organen. Wir haben festgestellt, dass Schweigen so früh wie 1 Tag nach der Injektion beginnt und kann bis zu 6 Tage nach der Injektion andauern. Verwenden Sie Transkript und Protein Nachweismethoden wie quantitative PCR und Western-Blot zu Schweigen zu validieren.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Megascript
kit
Ambion
for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy
Qiagen
For dsRNA purification
dsRNA
should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water