Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio Dimopoulos per iniettare dsRNA in zanzare Anopheles gambiae, che ospitano il parassita della malaria. La tecnica di manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.
Abstract
Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio Dimopoulos per iniettare dsRNA in zanzare Anopheles gambiae, che ospitano il parassita della malaria. La tecnica di manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.
Protocol
RNAi mediato silenziamento genico nelle zanzare richiede una preparazione preventiva e la purificazione della dsRNAs specifici che colpiscono il gene di interesse. Per la sintesi di dsRNA, si consiglia il kit Megascript Ambion che si avvale di un RNA polimerasi T7-mediata reazione di trascrizione in vitro. Per la purificazione dsRNA, si consiglia il kit Qiagen RNeasy. Campioni di dsRNA devono essere quantificati e regolata a 3 g / mL in acqua. Altri materiali è necessario includere: punta fine pinze, vetrino, …
Discussion
Efficienza del silenziamento genico è altamente variabile e dipende da una serie di fattori tra cui trascrizione e proteine turn-over tassi ed efficienza dsRNA assorbimento da parte delle cellule e organi. Abbiamo scoperto che il silenziamento inizia già dopo 1 iniezione al giorno e può durare fino a 6 giorni dopo l'iniezione. Utilizzare metodi di rilevamento trascrizione e proteine, come la PCR quantitativa e Western blotting per convalidare tacere.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Megascript
kit
Ambion
for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy
Qiagen
For dsRNA purification
dsRNA
should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water