Summary
هنا ، نحن تصف بروتوكول للثقافة العزلة والفئران من خلايا بطانة الأوعية الدموية الرئوية. يضم هذا الأسلوب ميكانيكي والأنزيمية تفارق أنسجة الرئة ، فضلا عن عملية تنقية 2 - خطوة استخدام الألغام المضادة للPECAM - 1 ومعاداة ICAM - 2 الأضداد مترافق إلى حبات المغناطيسي ، والتي تنتج الخلايا البطانية نقية السكان من أصل الاوعية الدموية الدقيقة في معظمها.
Abstract
الخلايا البطانية تقديم نموذج بحث مفيد في كثير من مجالات البيولوجيا الوعائية. منذ عزلتها الأول (1) ، وقد أظهرت خلايا بطانة الوريد السري (HUVECs) لتكون مريحة وسهلة للحصول على والثقافة ، وبالتالي هي أكثر الخلايا البطانية درس على نطاق واسع. ومع ذلك ، للبحث تركز على عمليات مثل الآخرين الأوعية الدموية والنفاذية أو كثيرة ، الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (ECS) هي نموذج أكثر بكثير من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة لدراسة 2. علاوة على ذلك ، ECS المعزولة من الفئران خروج المغلوب توفير أداة مفيدة لتحليل وظيفة البروتين فيفو السابقين. العديد من الطرق لعزل والاوعية الدموية الدقيقة ECS ثقافة المنشأ مختلفة تم الإبلاغ عنها حتى الآن 3-7 ، ولكن العزلة تتفق وثقافة نقية ECS لا يزال يمثل مشكلة رئيسية في العديد من المختبرات التقنية. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة على طريقة موثوقة وبسيطة نسبيا من عزل وزراعة الخلايا البطانية الرئة الماوس (MLECs). في هذا النهج ، وأنسجة الرئة التي تم الحصول عليها من 6 -- 8 ليوم هو أول خفض الجراء القديم إربا ، يتفاعل مع كولاجيناز / dispase (C / D) الحل وفرقت ميكانيكيا في وحيدة الخلية تعليق. ويجري تنقية MLECS من الايقاف الخلية باستخدام اختيار الإيجابي مع مضادات الأجسام المضادة PECAM - 1 مترافق لاستخدام المكثف Dynabeads الجسيمات المغناطيسية (MPC). يتم استزراع هذه الخلايا على تنقيته زراعة الأنسجة المغلفة الجيلاتين (TC) الأطباق حتى تصبح متموجة. عند هذه النقطة ، كذلك تنقية الخلايا باستخدام Dynabeads بالإضافة إلى مكافحة ICAM - 2 الأضداد. MLECs حصل مع هذا البروتوكول يحمل النمط الظاهري حصوه ، كما تصور المجهري ضوء التخلص النقيض من ذلك ، وتأكدت من النمط الظاهري البطانية FACS باستخدام التحليل المضادة للكادهيرين VE - 8 و 9 VEGFR2 المضادة للأضداد وتلطيخ مناعي من كادهيرين - VE. في أيدينا ، وهذا إجراء العزل من خطوتين باستمرار وبشكل موثوق تعطي السكان نقية من MLECs ، والتي يمكن أيضا مثقف. وهذه الطريقة تمكن الباحثين من الاستفادة من عدد متزايد من خروج المغلوب والفئران المعدلة وراثيا لربط مباشرة في الدراسات المجراة مع نتائج التجارب في المختبر أجريت على MLECs معزولة وبالتالي يساعد في الكشف عن الآليات الجزيئية لاحظ الأنماط الظاهرية الأوعية الدموية في الجسم الحي.
Protocol
1. إعداد حبات المغناطيسي مكافحة PECAM - 1 - الضد مترافق (Dynabeads)
- إعداد جيش صرب البوسنة 0.1 ٪ في برنامج تلفزيوني عن طريق خلط 50 ملغ في جيش صرب البوسنة PBS 50 مل باستخدام الدوامة حتى يذوب جيش صرب البوسنة. تعقيم بواسطة الترشيح من خلال 0،22 ميكرون تصفية المحاقن. المحل في 4 درجات مئوية.
- في هود TC ، ونقل 200 ميكرولتر من معلق Dynabeads الأغنام كذلك مفتش الحكومة لمكافحة الجرذان في أنبوب 1.5 مل إيبندورف وتغسل حبات : MPC على جبل أنبوب وترك الجلوس لحوالي 1 دقيقة للسماح للالخرز على الرسوبيات. نضح طاف ، إزالة أنبوب من MPC resuspend والخرز في 1 مل من 0.1 ٪ BSA العقيمة / برنامج تلفزيوني. ماصة صعودا وهبوطا لresuspend الخرز.
- تكرار غسل ثلاث مرات أكثر ، ليصبح المجموع أربعة يغسل.
- إزالة أنبوب من MPC resuspend والخرز في 500 ميكرولتر من 0.1 ٪ BSA / برنامج تلفزيوني.
- أضف 10 ميكرولتر الفئران لمكافحة فأر PECAM - 1 (CD - 31) الضد في أنبوب.
- تعثر بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في الغرفة الباردة أو 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل حبات مع جيش صرب البوسنة 0.1 ٪ معقمة / PBS كما هو موضح في الخطوة 1.2 أربع مرات.
- إزالة أنبوب من MPC resuspend والخرز في 200 BSA 0.1 ٪ ميكرولتر / برنامج تلفزيوني. متجر مكافحة PECAM - 1 - الضد مترافق Dynabeads في 4 درجات مئوية ليصل إلى 1 في الشهر.
2. الماوس الرئوي عزل الخلايا البطانية من الفئران حديثي الولادة
قبل المضي قدما في تنقية نسيج بروتوكول ، مطلوب IACUC اللجنة بالموافقة على هذا الإجراء.
- إعداد ما يلي :
- 15 مل من محلول 1 C / D ملغ / مل في DMEM. فلتر مع حقنة 0.22 ميكرون تصفية ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
- أنبوب 50 مل مع المخروطية DMEM 15 مل ، وتخزينها على الجليد
- العزلة وسائل الإعلام (IM) تحتوي على 20 ٪ FBS والبنسلين 1X / الستربتوميسين في DMEM
- 2 ٪ الجيلاتين. 2 غرام مزيج من الجلد البقري الجيلاتين مع 100 مل من الماء د ، 15 دقيقة الأوتوكلاف وتخزينها في 4 درجات مئوية. الحارة إلى 37 درجة مئوية لتسييل قبل قوارير TC الطلاء.
- تخدير three الجراء يوم 6-8 القديمة باستخدام حقنة IP من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). التحقق من فعالية التخدير وتشريح الحيوانات واحدا تلو الآخر ، على النحو التالي : الجراء دبوس إلى المجلس ، وامتصاص الجلد مع الايثانول 70 ٪ وإزالة الجلد من منطقة الصدر مع مقص تشريح العقيمة. استئصال القفص الصدري لفضح الرئتين.
- المكوس جو معقم و مطهر فصوص الرئة الفردية ، والحرص على عدم تشريح القصبات وأي نوع من الأنسجة الضامة وضوحا حول الرئتين. الجمع بين جميع الرئتين في الجليد الباردة DMEM. الموت ببطء الجراء.
- العاملة في هود TC ، إزالة فصوص الرئة من DMEM ، ومكان في صحن ملم TC 100 و نضح DMEM الزائدة.
- باستخدام مقص العقيمة ، واللحم المفروم ناعما النسيج عن طريق خفض ~ 100 مرات. نقل إلى 15 مل حل C / D الدافئة للهضم الأنزيمية. احتضان 45 دقيقة عند درجة 37 على محور دوار.
- في هود TC ، نضح تعليق الأنسجة هضمها في لحقنة 20 مل مع 14 كتل قنية ز المرفقة ويسحن في تعليق خلية واحدة ، على الأقل 12 مرة.
- تمرير تعليق الأنسجة من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر ، ويغسل مع مصفاة IM 15 مل لوقف عملية الهضم.
- بيليه التعليق على الخلايا بواسطة الطرد المركزي ز 400X لمدة 5 دقائق.
- نضح وطاف بيليه resuspend في 3 BSA 0.1 ٪ مل / برنامج تلفزيوني.
- تعليق نقل الخلية إلى 5 مل أنبوب البوليسترين جولة القاع وإضافة 22.5 ميكرولتر مكافحة PECAM - 1 - مترافق Dynabeads الأضداد. هبوط في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 دقيقة.
- معطف قارورة T75 الجيلاتين مع 2 مل 2 ٪ وفائض نضح الجيلاتين. السماح ليجف الجيلاتين داخل غطاء TC لحوالي 30 دقيقة قبل خلايا الطلاء.
- بعد حضانة حبة كاملة (الخطوة 2.10) ، وتقسيم الخلية تعليق على قدم المساواة في أنابيب إيبندورف الثلاثة وجبل على لجنة السياسة النقدية.
- عندما يكون الخرز الرسوبية به لجنة السياسة النقدية (~ 1 دقيقة) ، وجمع طاف ، وإزالة أنبوب من لجنة السياسة النقدية ، وتغسل حبات مع ~ 1 مل 0.1 ٪ BSA / PBS ، ثم صعد مرة ثانية على لجنة السياسة النقدية.
- تكرار غسل أربع مرات (المجموع 5 يغسل)
- الخرز Resuspend في 1 مل من VascuLife مع EnGS MV - الحياة العوامل كيت و1X البنسلين / الستربتوميسين (VL) لكل أنبوب ، والخلط جيدا.
- لوحة على قارورة T75 قبل المغلفة وجلب الحجم الإجمالي في كل قارورة إلى 10 مل مع VL.
- تغير وسائل الاعلام في اليوم التالي ، تسمح 1 يوم كامل من النمو ، ومن ثم تغيير نصف كل يوم وسائل الإعلام الأخرى. عندما الخلايا> 70-80 ٪ متموجة أو أكثر (عادة بعد 3-4 أيام للثقافة) ، ويمكن فرزها مع المضادة للICAM - 2 Dynabeads.
3. تستعد لمكافحة ICAM - 2 - الضد مترافق Dynabeads
- وتستخدم Dynabeads مكافحة ICAM - 2 - مترافق الضد لتنقية المزيد من الخلايا التي تم اختيارها مع المضادة للPECAM - 1 - الضد مترافق Dynabeads والمثقفين حتى متموجة. يتم تنفيذ هذا الإجراء كما هو موضح لمكافحة Dynabeads PECAM - 1 - مترافق الأضداد (1 أعلاه) ، إلا أن معاداة الماوس ICAM - 2 (CD - 102) ويستخدم بدلا من الأضداد المضادة للPECAM 1 - الأضداد.
- ويمكن تخزين Dynabeads مكافحة ICAM - 2 - مترافق الأضداد في 4 درجات مئوية لمدة تصلإلى 1 في الشهر.
4. فرز خلايا الرئة ماوس غشائي المضادة للICAM - 2 Dynabeads
- معطف زراعة الأنسجة T75 قارورة مع 2 ٪ الجيلاتين.
- نضح في وسائل الاعلام من القارورة T75 متموجة مع الخلايا وتغسل مع PBS مل 8.
- نضح PBS ، إضافة 2 مل 0.05 ٪ التربسين / EDTA وترك الخلايا فصل (حوالي 5 دقائق). اضغط على قوارير برفق لفصل المساعدات.
- عندما يكون فصل الخلايا ، إضافة 2 مل IM لمنع التربسين وكشط الخلايا لفصل أي الخلايا المتبقية ملتصقة. تعليق نقل الخلية إلى أنبوب 15 مل وتدور باستمرار لمدة 5 دقائق في غرام 400X
- نضح في وسائل الإعلام وresuspend بيليه خلية في جيش صرب البوسنة 0.1 ٪ 2 مل / برنامج تلفزيوني.
- نقل إلى أنبوب 5 مل جولة القاع البوليسترين وإضافة 10 ميكرولتر مكافحة ICAM - 2 Dynabeads. تعثر لمدة 12 دقيقة في RT.
- انقسام الخلية إلى قسمين تعليق أنابيب 1.5 مل إيبندورف وجبل على لجنة السياسة النقدية.
- نضح طاف بعد حبات انضمت لدقيقة واحدة. إزالة الأنابيب من MPC وresuspend كل أنبوب في جيش صرب البوسنة 1 0.1 ٪ مل / برنامج تلفزيوني. صعد مرة ثانية على لجنة السياسة النقدية.
- تكرار غسل أربع مرات (ما مجموعه 5 يغسل).
- Resuspend كل أنبوب مع VL 1 مل وتنفيذ عدد الخلايا.
- في لوحة الخلايا 250 خلية لكل 350K T25 قارورة و / أو 750K - 1 مليون خلية في T75 القارورة.
- ليصل حجم 5 مل VL T25 في القوارير ، و 10 مل في T75 القوارير.
- تغير وسائل الاعلام كل يوم. ويمكن استخدام الخلايا لإجراء التجارب عندما تصل الثقافة حوالي 80 ٪ confluency ، وعادة في غضون 2-3 أيام.
5. ممثل النتائج
عادة ، بعد 6-7 أيام من التحضير الأولي للخلايا ، ونحن قادرون على الحصول على حوالي 1،2-1،5 × 10 6 خلايا بطانة الأوعية الدموية الرئوية من ثلاثة ايام الجراء 6-8 القديمة. عرض خلايا نموذجية "الحصوه" التشكل تحت المجهر الخفيفة وتظهر VE - كادهيرين (CD144) في تلطيخ خلية خلية التقاطعات ، والتي تتميز عن الخلايا البطانية (الشكل 1). أعرب غالبية MLECs كادهيرين - VE VEGFR2 وكما يتبين من تحليل FACS (الشكل 2). عادة ، ونحن استخدامها لاجراء تجارب في غضون اسبوعين بعد عزل MLEC الأولي.
الشكل 1. التحليل المجهري للأحادي الطبقة MLEC متموجة. (أ) صورة الخفيفة المجهري يظهر مورفولوجيا الحصوه من الخلايا مثقف نموذجي للخلايا بطانة الأوعية الدموية. هياكل موحدة الجولة الواقعة في منطقة محيط بالنواة العديد من الخلايا التي هي حبات المغناطيسي المستخدمة لعزل MLEC. (ب) هو مترجم غشائي محددة VE - كادهيرين في تقاطعات خلية خلية كما هو موضح باستخدام المجهر مبائر. البار ممثل 20μm.
الشكل 2 FACS تحليل MLECs مثقف المسمى مع الأجسام المضادة المحددة لالبطانية علامات محددة : VE - كادهيرين (CD144) أو VEGFR2 ، كما اتهم ، تليها فيكوإيريترين - مترافق الضد الثانوية ، يؤكد هوية من البطانية MLECs معزولة. خط أحمر يشير isotype محددة السيطرة ، يشير الخط الأخضر المضادة للVE - كادهيرين أو معادية للVEGFR2 - -- مفتش الحكومة محددة.
Discussion
وقد أثبتت ECS الاوعية الدموية الدقيقة ليكون نموذجا مفيدا في كثير من مجالات البيولوجيا الوعائية ويعتقد أن يكون أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية للدراسة (مثل الأوعية الدموية) من HUVECs درس على نطاق واسع 3. سابقا ، وقد ذكرت أنه يمكن الحصول عليها من الاوعية الدموية الدقيقة ECS والكلى القلب والأنسجة الدهنية الجلد ، وشبكية العين والدماغ والاورام الدبقية ، وكذلك سرطان الرئة 2 ، 4-7 ، 10 ، 11. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة طريقة متسقة وموثوق بها لعزل ECS الاوعية الدموية الدقيقة. الإجراء المعروض هنا هو تعديل للبروتوكول تنطبق 2 ؛ فهو يختلف عن معظم الإجراءات التي نشرت في أنه يستخدم بدلا من الجراء الحيوانات البالغة. هذا أمر بالغ الأهمية لنجاح العزلة والخلايا من الحيوانات الصغيرة لديها أعلى احتمال انتشار والثقافات المستمدة من أنسجتها ، تميل إلى العائد أعلى عدد من الخلايا. الحيوانات أسبوع واحد من العمر ويبدو أن أمثل ، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا الفئران الأصغر (4 أيام من العمر) يكون. أيضا ، يمكن أن يستخدم هذا الرقم أعلى أو أقل من الجراء إذا لزم الأمر ، كما أننا نجحنا في عزل MLECs من الجرو. ومع ذلك ، في حين أن التوسع صعودا أو هبوطا في عملية العزلة ، ويجب أن الخلية كثافة الطلاء لم تتغير ، وهذا أمر بالغ الأهمية أيضا لتكاثر الخلايا. عملية تنقية 2 - خطوة من MLECs باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق أول 1 - PECAM ومكافحة الألغام المضادة للICAM - 2 الأضداد هو أكثر فاعلية في الحصول على الثقافات الأوروبية نقية من الإجراءات المذكورة سابقا تنقية خطوة واحدة. هذا البروتوكول يلغي الحاجة إلى استخدام التقنيات اليدوية شاقة جدا ، والطرد المركزي والتدرج FACS أقل كفاءة الفرز للخلايا نبذ تلويث مثل الخلايا الليفية ، وخلايا الدم وخلايا العضلات الملساء. ويمكن استخدام السكان الناجمة عن MLEC في التحليل المعملي للردود عائية ، نفاذية الأوعية الدموية والتهجير الكريات البيض ، التئام الجروح ، فضلا عن تحليل الإشارات البيوكيميائية الممرات. إذا لزم الأمر ، يمكن مطلي MLECs على الأسطح المختلفة مثل الجيلاتين coverslips فبرونيكتين أو المغلفة للصفائف المناعي أو العابرة للقطب البطاني القياسات (TER) المقاومة. ويمكن مقارنة النتائج المتحصل عليها مباشرة إلى الظواهر التي لوحظت في الجسم الحي ، وهو أمر مهم لا سيما في سياق العدد المتزايد من خروج المغلوب وخطوط الفأر المعدل وراثيا. وقد تم بالفعل تنفيذ الناجح لهذا الأسلوب في التحليل المختبري من الآليات الخلوية الكامنة العيوب التي لوحظت في الجسم الحي ، قدم 12.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها كلية الطب في ويسكونسن IACUC اللجنة بموجب البروتوكول AUA # 00001206.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث في جزء من القلب الأميركية 0950118G.to منح رابطة MC - W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Maruyama, Y. The human endothelial cell in tissue culture. Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).
- Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circ Res. 100, 158-173 (2007).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).
- Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).
- Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).
- Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues. J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).
- Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).
- Zachary, I., Gliki, G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).
- Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization. Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).
- Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice. Blood. 111, 2647-2656 (2008).
