Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von murinen pulmonalen Endothelzellen. Dieses Verfahren umfasst mechanische und enzymatische Lungengewebe Dissoziation sowie eine 2-Schritt-Reinigungsverfahren mit anti-PECAM-1 und anti-ICAM-2-Antikörper, konjugiert an magnetische Kügelchen, die eine reine Endothelzellen Bevölkerung meist mikrovaskuläre Herkunft produziert.
Abstract
Endothelzellen stellen einen nützlichen Forschung Modell in vielen Bereichen der vaskulären Biologie. Seit der ersten Isolierung 1, haben menschliche Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) gezeigt werden, bequem, leicht zu beschaffen und Kultur, und damit sind die am häufigsten untersuchten Endothelzellen. Doch für die Forschung an Prozessen wie Angiogenese, Permeabilität oder viele andere konzentriert, sind mikrovaskuläre Endothelzellen (ECs) eine viel physiologisch relevante Modell-2-Studie. Darüber hinaus ECs isoliert von Knockout-Mäusen ein nützliches Werkzeug für die Analyse von Protein-Funktion ex vivo. Verschiedene Ansätze zu isolieren und Kultur mikrovaskulären ECs unterschiedlicher Herkunft sind bisher 3-7 berichtet worden, aber konsequente Isolierung und Kultivierung von reinem ECs immer noch ein großes technisches Problem in vielen Laboratorien. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll auf eine zuverlässige und relativ einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung Mauslunge Endothelzellen (MLECs). Bei diesem Ansatz Lungengewebe von 6 erhalten - bis 8-Tage alte Jungtiere zunächst in Stücke geschnitten wird, verdaut mit Kollagenase / Dispase (C / D)-Lösung und verteilt mechanisch in den Single-Zellsuspension. MLECS aus Zellsuspension unter Verwendung einer positiven Selektion mit anti-PECAM-1-Antikörper, konjugiert mit Dynabeads mit Hilfe eines Magnetic Particle Concentrator (MPC). Solche gereinigten Zellen auf Gelatine-beschichteten Gewebekultur (TC) Schalen kultiviert, bis sie konfluent geworden. Zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen weiter gereinigt mit Dynabeads gekoppelt anti-ICAM-2 Antikörpers. MLECs mit diesem Protokoll erhaltenen weisen einen Pflasterstein Phänotyp, wie visualisiert Phasenkontrast-Lichtmikroskopie und ihre endothelialen Phänotyp bestätigt wurde mittels FACS-Analyse mit anti-VE-Cadherin-8 und anti-VEGFR2 9 Antikörper und Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherin. In unseren Händen, das Zwei-Schritt-Isolierung Verfahren konsistent und zuverlässig liefert eine reine Population von MLECs, die weiter kultiviert werden können. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die Vorteile der wachsenden Zahl von Knockout-und transgenen Mäusen direkt in vivo Studien korrelieren mit den Ergebnissen von in vitro Experimenten an isolierten MLECs durchgeführt zu nehmen und so dazu beitragen, die molekularen Mechanismen der vaskulären Phänotypen in vivo beobachtet zu offenbaren.
Protocol
1. Vorbereitung anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierten magnetischen Beads (Dynabeads)
- Bereiten Sie 0,1% BSA in PBS durch Mischen von 50 mg BSA in 50 ml PBS mit einem Vortex bis BSA auflöst. Sterilisieren durch Filtration durch 0,22 um Spritzenfilter. Lagerung bei 4 ° C.
- In den TC Kapuze, Transfer 200 ul gut resuspendiert Schaf-anti-Ratte IgG Dynabeads in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und waschen Sie die Perlen: Mount Tube auf MPC und lassen Sie sich für etwa 1 min bis die Perlen in das Sediment zu ermöglichen. Saugen Sie den Überstand, entfernen Sie den Schlauch vom MPC und Resuspendieren der Beads in 1 ml steriler 0,1% BSA / PBS. Pipette auf und ab, um Perlen zu resuspendieren.
- Wiederholen Sie waschen drei weitere Male, für insgesamt vier Waschgänge.
- Entfernen Rohr aus MPC und Resuspendieren der Beads in 500 ul 0,1% BSA / PBS.
- Fügen Sie 10 ul Ratte anti-Maus-PECAM-1 (CD-31) Antikörper gegen das Rohr.
- Tumble über Nacht bei 4 ° C im Kühlraum oder 2 Stunden bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Perlen mit steriler 0,1% BSA / PBS, wie in Schritt 1.2 viermal beschrieben.
- Entfernen Rohr aus MPC und Resuspendieren der Beads in 200 ul 0,1% BSA / PBS. Shop anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
2. Isolating Maus pulmonalen Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen
, Bevor Sie fortfahren mit dem Gewebe Aufreinigungsprotokolls ist IACUC Ausschusses Genehmigung des Verfahrens erforderlich.
- Bereiten Sie die folgenden:
- 15 ml von 1 mg / ml C / D-Lösung in DMEM. Filter mit 0,22 um Spritzenfilter und warm bis 37 ° C.
- 50 ml konische Röhrchen mit 15 ml DMEM, speichern auf Eis
- Isolation Media (IM) mit 20% FBS und 1x Penicillin / Streptomycin in DMEM
- 2% Gelatine. Mix 2 g Rinder-Gelatine mit 100 ml Wasser dd, Autoklaven 15 Minuten und lagern bei 4 ° C. Warm bis 37 ° C vor der Beschichtung TC Flaschen zu verflüssigen.
- Anesthetize drei 6-8 Tage alte Jungtiere mit einer IP-Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Prüfen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie und sezieren Tiere eins nach dem anderen, wie folgt: Pin Welpen an Bord, genießen die Haut mit 70% Ethanol und entfernen Sie die Haut vor den Brustbereich mit einer sterilen Schere Dissektion. Excise den Brustkorb zu Lungen freizulegen.
- Aseptisch Verbrauchsteuern einzelnen Lungenlappen, man aufpassen, nicht zu sezieren die Bronchien und sichtbare Bindegewebe in der Lunge. Kombinieren Sie alle Lunge in eiskaltem DMEM. Euthanize die Welpen.
- Arbeiten in der TC Kapuze, entfernen Lungenlappen aus DMEM, in einem 100 mm TC Schüssel und saugen überschüssiges DMEM.
- Mit einer sterilen Schere, Hackfleisch das Gewebe fein schneiden ~ 100 mal. Transfer zum 15 ml warmes C / D-Lösung für die enzymatische Verdauung. Inkubieren 45 Minuten bei 37 ° C auf einem Rotator.
- In den TC Haube absaugen verdaute Gewebe Suspension in eine 20 ml Spritze mit 14 g Kanüle befestigt und verreiben Klumpen in einer einzigen Zellsuspension, mindestens 12 mal.
- Pass das Gewebe Suspension durch ein 70 um Zellsieb und waschen Sie das Sieb mit 15 ml IM, um die Verdauung zu stoppen.
- Pellet Zellsuspension durch Zentrifugation bei 400x g für 5 Minuten.
- Saugen Sie den Überstand und Pellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS.
- Transfer Zellsuspension 5 ml Rundboden-Röhrchen aus Polystyrol und fügen 22,5 ul anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads. Tumble bei Raumtemperatur für 12 Minuten.
- Coat einer T75-Kolben mit 2 ml 2% Gelatine und saugen überschüssige Gelatine. Lassen Gelatine innerhalb der TC Haube für etwa 30 Minuten vor dem Beschichten Zellen trocknen.
- Nach bead Inkubation abgeschlossen ist (Schritt 2,10), Zellsuspension in drei gleich große Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt und Halterung an der MPC.
- Wenn die Perlen haben sedimentiert mit dem MPC (~ 1 min), sammeln Überstand entfernen Rohr von MPC, waschen Perlen mit ca. 1 ml 0,1% BSA / PBS und dann remount auf der MPC.
- Wiederholen Sie waschen viermal (insgesamt 5 Wäschen)
- Resuspendieren Perlen in 1 ml VascuLife mit ENGS-Mv Leben Factors Kit und 1x Penicillin / Streptomycin (VL) pro Röhrchen gut mischen.
- Platte auf einem vorbeschichteten T75 Kolben und bringen Gesamtvolumen in jedem Kolben bis 10 ml mit VL.
- Ändern Medien am folgenden Tag, lassen Sie 1 Tag voller Wachstum und ändern Sie dann die Hälfte der Medien jeden zweiten Tag. Wenn die Zellen> 70-80% konfluent oder mehr (in der Regel nach 3-4 Tagen der Kultur) sind, können sie mit anti-ICAM-2 Dynabeads sortiert werden.
3. Vorbereitung anti-ICAM-2-Antikörper-konjugierte Dynabeads
- Anti-ICAM-2-Antikörper-konjugierte Dynabeads werden verwendet, um weiter zu reinigen Zellen, die mit anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads und kultiviert, bis konfluenten ausgewählt wurden. Dieses Verfahren wird durchgeführt, wie für anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads (1, oben) beschrieben, außer dass anti-Maus-ICAM-2 (CD-102)-Antikörper anstelle von anti-PECAM-1-Antikörper verwendet.
- Anti-ICAM-2-Antikörper-konjugierte Dynabeads können bei 4 ° C gelagert werden biszu 1 Monat.
4. Sortieren Mauslunge Endothelzellen mit anti-ICAM-2 Dynabeads
- Coat T75 Zellkulturflasche mit 2% Gelatine.
- Saugen Sie das Medium aus dem konfluenten T75 Kolben mit Zellen und wäscht mit 8 ml PBS.
- Absaugen PBS, 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA und lassen Zellen lösen (ca. 5 Minuten). Tippen Sie auf Flaschen leicht zu Hilfe Abnehmen.
- Wenn die Zellen abgelöst haben, fügen Sie 2 ml IM zu Trypsin und kratzen Zellen zu hemmen, um alle verbleibenden adhärenten Zellen zu lösen. Transfer Zellsuspension auf eine 15 ml Tube und Spin-Down für 5 min bei 400x g
- Saugen Sie die Medien und resuspendieren Zellpellet in 2 ml 0,1% BSA / PBS.
- Transfer in ein 5 ml Polystyrol Rundboden-Röhrchen und fügt 10 ul anti-ICAM-2 Dynabeads. Tumble für 12 Minuten bei RT.
- Split Zellsuspension in zwei 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und montieren auf MPC.
- Saugen Sie den Überstand nach Perlen für 1 Minute haben eingehalten werden. Entfernen Rohre von MPC und resuspendieren jedes Röhrchen in 1 ml 0,1% BSA / PBS. Montieren Sie auf MPC.
- Wiederholen Sie waschen viermal (insgesamt 5 Wäschen).
- Resuspendieren jedes Röhrchen mit 1 ml VL und führen Sie eine Zellzahl.
- Platte Zellen bei 250-350K-Zellen pro T25 Kolben und / oder 750K-1 Millionen Zellen pro T75 Kolben.
- Bringt Volumen 5 ml VL in T25 Flaschen und 10 ml in T75 Flaschen.
- Ändern Medien jeden zweiten Tag. Die Zellen können für Experimente verwendet werden, wenn Kultur erreicht etwa 80% Konfluenz, in der Regel in 2-3 Tagen.
5. Repräsentative Ergebnisse
In der Regel nach 6-7 Tagen ab dem ersten Vorbereitung der Zellen, sind wir in der Lage, etwa 1,2 zu erhalten - 1,5 x 10 6 pulmonalen Endothelzellen aus drei 6-8 Tage alte Jungtiere. Zellen zeigen typische "Kopfsteinpflaster" Morphologie unter Lichtmikroskopie und zeigen, VE-Cadherin (CD144)-Färbung bei Zell-Zell-Verbindungen, die charakteristisch für Endothelzellen (Abbildung 1) ist. Mehrheit der MLECs ausdrückliche VE-Cadherin und VEGFR2 wie durch FACS-Analyse (Abbildung 2) gezeigt. Normalerweise benutzen wir sie für Experimente innerhalb von zwei Wochen nach der ersten MLEC Isolation.
Abbildung 1. Mikroskopische Analyse von konfluenten MLEC Monoschicht. (A) Lichtmikroskopische Bild zeigt Kopfsteinpflaster Morphologie der kultivierten Zellen typisch für Endothelzellen. Uniform runde Gebilde in den perinukleären Bereich von vielen Zellen befindet sich die magnetischen Beads für MLEC Isolierung verwendet. (B) Endothelial-spezifische VE-Cadherin an der Zell-Zell-Verbindungen wie gezeigt mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie lokalisiert. Bar ist repräsentativ für 20 um.
Abbildung 2 FACS-Analyse von kultivierten MLECs mit Antikörpern, die spezifisch für Endothel-spezifischen Markern versehen:. VE-Cadherin (CD144) oder VEGFR2, wie angeklagt, von Phycoerythrin-konjugierten sekundären Antikörper folgte, bestätigt endothelial Identität der isolierten MLECs. Rote Linie zeigt Isotyp-spezifische Steuerung, zeigt grüne Linie anti-VE-Cadherin-oder Anti-VEGFR2 - spezifischen IgG-.
Discussion
Mikrovaskulären ECs haben sich als nützliches Modell in vielen Bereichen der vaskulären Biologie und sind vermutlich mehrere physiologisch relevanten Studie (zB Angiogenese) als weitgehend untersucht HUVECs 3. Zuvor wurde berichtet, dass mikrovaskuläre Endothelzellen aus Niere, Herz, Haut, Netzhaut, Gehirn, Gliome, Fettgewebe und auch Lunge 2, 4-7, 10, 11 erzielt werden kann. Allerdings ist eine konsistente und zuverlässige Methode zur Isolierung von mikrovaskulären ECs weiterhin erforderlich. Das hier vorgestellte Verfahren ist eine Modifikation eines bereits veröffentlichten Protokoll 2, es unterscheidet sich von den meisten veröffentlichten Verfahren durch die Nutzung der Welpen anstelle von erwachsenen Tieren. Dies ist entscheidend für die Isolierung Erfolg als Zellen von jungen Tieren eine höhere Verbreitung Potential haben und Kulturen aus ihren Geweben stammen in der Regel höhere Anzahl der Zellen zu erhalten. Eine Woche alten Tiere scheinen optimal zu sein, aber jüngere Mäuse (4 Tage alten) können ebenfalls verwendet werden. Auch können höhere oder niedrigere Anzahl von Jungtieren bei Bedarf verwendet werden, wie wir schon bei der Isolierung MLECs von einem Welpen haben erfolgreich. Doch während die Skalierung nach oben oder unten die Isolierung Prozess muss Zelle Plattierungsdichte bleiben unverändert, wie dies auch von entscheidender Bedeutung für die Zellproliferation. Die 2-Schritt-Reinigungsverfahren MLECs mit magnetischen Beads konjugiert erste anti-PECAM-1 und als anti-ICAM-2-Antikörper ist viel effizienter bei der Gewinnung von reinem EG Kulturen als die zuvor beschriebenen einstufigen Reinigungsverfahren. Dieses Protokoll entfällt die Notwendigkeit, sehr aufwändige manuelle Techniken, Gradientenzentrifugation und weniger effizient FACS-Sortierung für das Verwerfen kontaminierenden Zellen wie Fibroblasten, Blutzellen und Zellen der glatten Muskulatur zu verwenden. Die daraus resultierende MLEC Bevölkerung kann für die in vitro Analyse der angiogenen Reaktion, Gefäßpermeabilität und Leukozyten-Transmigration, Wundheilung sowie biochemische Untersuchung von Signalwegen verwendet werden. Falls erforderlich, kann MLECs auf verschiedenen Oberflächen wie Fibronektin oder Gelatine-beschichtete Deckgläser für Immunfluoreszenz oder Elektroden-Arrays für die trans-endothelialen Widerstand (TER) Messungen beschichtet werden. Die erhaltenen Ergebnisse können direkt an die Phänotypen in vivo, was besonders wichtig ist im Zusammenhang mit der wachsenden Zahl von Knockout und transgene Mauslinien beobachtet verglichen werden. Die erfolgreiche Umsetzung dieses Verfahrens zur in vitro Analyse von zellulären Mechanismen, die Mängel in vivo zu beobachten, wurde bereits 12 dargestellt.
Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch Medical College of Wisconsin IACUC Ausschuss unter-Protokoll AUA # 00001206 eingestellt durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch American Heart Association gewähren 0950118G.to MC-W unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Maruyama, Y. The human endothelial cell in tissue culture. Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).
- Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circ Res. 100, 158-173 (2007).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).
- Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).
- Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).
- Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues. J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).
- Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).
- Zachary, I., Gliki, G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).
- Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization. Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).
- Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice. Blood. 111, 2647-2656 (2008).
