Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.
Abstract
לתאי אנדותל לספק מודל מחקר שימושי בתחומים רבים של הביולוגיה וסקולרית. מאז הבידוד הראשון שלה 1, אדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVECs) הראו להיות נוח, קל להשיג והתרבות, ובכך הם לתאי אנדותל ביותר למד נרחב. עם זאת, המחקר התמקד בתהליכים כמו אחרים, אנגיוגנזה חדירות או רבים, לתאי אנדותל כלי הדם (ECS) הם מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הרבה יותר ללמוד 2. יתר על כן, ECS מבודד עכברים knockout לספק כלי יעיל לניתוח של vivo תפקוד החלבון לשעבר. מספר גישות לבודד כלי הדם תרבות ECS ממוצא שונה דווחו עד כה 3-7, אבל הבידוד תרבות עקבית של טהור ECS עדיין בעיה טכנית גדולה במעבדות רבות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד על שיטה אמינה פשוטה יחסית של בידוד ועכבר culturing הריאות לתאי אנדותל (MLECs). בגישה זו, רקמת הריאה המתקבל 6 - עד היום-8 גורים הישן החתך הראשון לחתיכות, מעוכל עם collagenase / dispase (C / D) פתרון והתפזרו מכני לתוך ההשעיה תא בודד. MLECS הם מטוהרים מן ההשעיה התא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן אנטי PECAM-1 מצומדות כדי Dynabeads מרוכז באמצעות חלקיקים מגנטיים (MPC). תאים אלה בתרבית מטוהרים על תרבות ג'לטין מצופה רקמה (TC) מנות עד שהם הופכים ומחוברות. בשלב זה, התאים עוד מטוהרים באמצעות Dynabeads מצמידים את הנוגדן אנטי ICAM 2. MLECs שהושגו עם פרוטוקול זה תערוכה פנוטיפ המרוצף, דמיינו כפי מיקרוסקופיה שלב לעומת האור, פנוטיפ האנדותל שלהם אושרה באמצעות ניתוח FACS עם אנטי VE-cadherin 8 ואנטי VEGFR2 9 נוגדנים מכתים immunofluorescent של cadherin-VE. בידיים שלנו, זה הליך בן שני שלבים בידוד עקבית ומהימנה התשואות אוכלוסייה טהורה של MLECs, אשר יכול להיות מתורבת יותר. שיטה זו תאפשר לחוקרים לנצל מספר גדל והולך של בנוקאאוט ו העכברים הטרנסגניים ישירות לתאם במחקרים vivo עם תוצאות של ניסויים במבחנה שבוצעו על MLECs מבודד ובכך לסייע לחשוף את המנגנונים המולקולריים של פנוטיפים כלי דם נצפתה in vivo.
Protocol
1. הכנת חרוזים מגנטיים אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות (Dynabeads)
- הכן BSA 0.1% ב PBS על ידי ערבוב 50 מ"ג BSA ב 50 מ"ל PBS באמצעות מערבולת עד BSA מתמוסס. לעקר ידי סינון דרך המסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C.
- ב למכסה המנוע TC, העברת 200 μl של resuspended גם אנטי עכברוש Dynabeads כבשים IgG לתוך צינור 1.5 Eppendorf מ"ל ולשטוף את החרוזים: צינור על הר MPC ולתת לשבת במשך דקות על 1 כדי לאפשר חרוזים משקעים. לשאוב supernatant, להסיר את הצינור מתוך MPC ו resuspend את החרוזים של 1 מ"ל סטרילי 0.1% BSA / PBS. פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend חרוזים.
- חזור על לשטוף שלוש פעמים נוספות, ובסך הכל ארבע שוטף.
- הסר צינור מ MPC ו resuspend את החרוזים 500 μl של 0.1% BSA / PBS.
- הוסף 10 μl עכברוש אנטי עכבר PECAM-1 (CD-31) נוגדנים הצינור.
- מיועד לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר או 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את החרוזים עם סטרילי 0.1% BSA / PBS כמתואר בשלב 1.2 ארבע פעמים.
- הסר צינור מ MPC ו resuspend את החרוזים 200 μl 0.1% BSA / PBS. חנות אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות Dynabeads על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1.
2. בידוד ריאתי עכבר לתאי אנדותל מעכברים בילוד
לפני שתמשיך עם פרוטוקול טיהור רקמות, IACUC אישור הוועדה של ההליך הנדרש.
- הכן את הפעולות הבאות:
- 15 מ"ל של תמיסת 1 C / D מ"ג / מ"ל DMEM. מסנן עם מזרק 0.22 מיקרומטר לסנן חם 37 ° C.
- 50 צינור חרוטי מ"ל עם 15 מ"ל DMEM, לאחסן על הקרח
- בידוד מדיה (IM) המכיל 20% FBS ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין ב DMEM
- ג'לטין 2%. מערבבים 2 גרם של עור שור ג'לטין עם מים dd 100 מ"ל, החיטוי 15 דקות בחנות ב 4 ° C. חם עד 37 ° C כדי לנזל לפני צלוחיות ציפוי TC.
- הרדימי three 6-8 גורים יום ישנות באמצעות זריקה IP של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג). בדיקת היעילות של הרדמה לנתח חיות אחד אחד, כדלקמן: גורים פין ללוח, להשרות עור עם אתנול 70% ולהסיר עור מאזור החזה במספריים לנתיחה סטרילית. כלוב הצלעות והבלו לחשוף את הריאות.
- הבלו בסביבה נקייה מחיידקים אונות ריאה בודדות, נזהרים שלא לנתח את הסמפונות וכל רקמת חיבור גלוי סביב הריאות. מערבבים את כל הריאות ב קר כקרח DMEM. להרדים את הגורים.
- עבודה למכסה המנוע TC, להסיר אונות ריאה מן DMEM, מקום צלחת 100 מ"מ ו - TC לשאוב DMEM עודף.
- בעזרת מספריים סטריליות, לקצץ את הרקמה דק ידי חיתוך ~ 100 פעמים. העברה 15 מ"ל פתרון חמים C / D של עיכול אנזימטי. דגירה 45 דקות 37 ° C על הכתף.
- ב למכסה המנוע TC, לשאוב את ההשעיה רקמות מעוכל לתוך מזרק כדי 20 מ"ל עם 14 גרם גושים הצינורית מחוברת triturate לתוך ההשעיה תא בודד, לפחות 12 פעמים.
- לעבור את ההשעיה רקמה דרך מסננת תא 70 מיקרומטר ו לשטוף את מסננת עם 15 מ"ל IM להפסיק העיכול.
- גלולה ההשעיה התא על ידי צנטריפוגה בשעה 400x גרם במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS.
- העברת ההשעיה תא 5 הצינור מסביב לתחתית מ"ל פוליסטירן ולהוסיף 22.5 μl אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות Dynabeads. מיועד בטמפרטורת החדר למשך 12 דקות.
- מעיל בקבוקון T75 עם 2 מ"ל 2% לטין עודף לשאוב ג'לטין. ג'לטין אפשר להתייבש בתוך מכסה המנוע TC עבור כ -30 דקות לפני תאים ציפוי.
- לאחר דגירה חרוז תושלם (שלב 2.10), השעיה לפצל תא באופן שווה לשלושה צינורות Eppendorf והר על MPC.
- כאשר החרוזים יש משקעים באמצעות MPC (~ 1 דקות), לאסוף supernatant, להסיר את הצינור מתוך MPC, לשטוף עם חרוזים ~ 1 מ"ל 0.1% BSA / PBS, ולאחר מכן לעלות שוב על MPC.
- חזור על לשטוף ארבע פעמים (סה"כ 5 שוטף)
- חרוזים Resuspend ב 1 מ"ל של VascuLife עם EnGS-MV גורמים החיים קיט 1x פניצילין / סטרפטומיצין (VL) לכל צינור, לערבב היטב.
- פלייט על בקבוק T75 מראש מצופה להביא הנפח הכולל בבקבוק 10 מ"ל כל אחד עם VL.
- שינוי התקשורת למחרת, לאפשר 1 יום שלם של צמיחה, ולאחר מכן שנה וחצי של התקשורת בכל יום אחר. כאשר התאים> 70-80% ומחוברות או יותר (בדרך כלל לאחר 3-4 ימים של התרבות), הם יכולים להיות מסודר עם אנטי ICAM-2 Dynabeads.
3. הכנת אנטי ICAM-2-נוגדן מצומדות Dynabeads
- Dynabeads Anti-ICAM-2-נוגדן מצומדות משמשים עוד לטהר תאים נבחרו עם אנטי PECAM-1 Dynabeads נוגדנים מצומדות ומתורבתים עד ומחוברות. הליך זה מבוצע כפי שתואר עבור Dynabeads אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות (1, לעיל), אלא אנטי עכבר ICAM-2 (CD-102) הנוגדנים משמש במקום נוגדן אנטי PECAM 1.
- Dynabeads Anti-ICAM-2-נוגדן מצומדות ניתן לאחסן 4 ° C עדחודש 1.
4. מיון ריאות עכבר לתאי אנדותל עם אנטי ICAM-2 Dynabeads
- T75 מעיל רקמה תרבות בקבוק עם 2% ג'לטין.
- לשאוב התקשורת מהבקבוק T75 ומחוברות עם תאים ולשטוף עם 8 מ"ל PBS.
- לשאוב PBS, להוסיף 2 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA ולתת תאים לנתק (כ -5 דקות). הקש צלוחיות קלות לסייע ניתוק.
- כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף 2 מ"ל IM לעכב תאים טריפסין ו לגרד לנתק את כל התאים הנותרים חסיד. העברת ההשעיה התא צינור 15 מ"ל ו - ספין למטה 5 דקות בשעה 400x g.
- לשאוב התקשורת resuspend תא גלולה ב 2 מ"ל 0.1% BSA / PBS.
- מעבירים צינור 5 פוליסטירן מסביב לתחתית מ"ל ולהוסיף 10 μl אנטי ICAM-2 Dynabeads. מיועד עבור 12 דקות RT.
- פיצול התא השעיה לשני 1.5 מ"ל Eppendorf צינורות לעלות על MPC.
- לשאוב supernatant לאחר חרוזים דבקו למשך דקה אחת. הסר צינורות מ MPC ו resuspend כל הצינורית 1 מ"ל 0.1% BSA / PBS. טען מחדש על MPC.
- חזור על לשטוף ארבע פעמים (סה"כ 5 שוטף).
- Resuspend כל צינור עם 1 מ"ל VL ולבצע ספירת התאים.
- פלייט תאים ב 250-350K תאים לכל בקבוק T25 ו / או 750 אלף-1 מיליון תאים לכל בקבוק T75.
- תביאו נפח VL 5 מ"ל ב T25 צלוחיות, ו 10 מ"ל ב T75 צלוחיות.
- שינוי התקשורת בכל יום אחר. תאים יכול לשמש בניסויים כאשר התרבות מגיע לכ 80% confluency, בדרך כלל 2-3 ימים.
5. נציג תוצאות
בדרך כלל, לאחר 6-7 ימים מיום ההכנה הראשונית של התאים, אנו מסוגלים לקבל על 1.2-1.5 x 10 6 לתאי אנדותל ריאתי משלושה 6-8 גורים בני יומם. תאים להציג מורפולוגיה טיפוסית "המרוצף" תחת מיקרוסקופ אור ולהראות VE-cadherin (CD144) מכתים על תאים תאים צמתים, האופייני לתאי האנדותל (איור 1). רוב MLECs להביע VE-cadherin ו VEGFR2 כפי שמגלה הניתוח FACS (איור 2). בדרך כלל, אנחנו משתמשים בהם לניסויים תוך שבועיים לאחר הבידוד MLEC הראשונית.
באיור 1. ניתוח מיקרוסקופי של monolayer MLEC ומחוברות. (א) תמונת מיקרוסקופ אור המרוצף מראה מורפולוגיה של תאים בתרבית אופייני לתאי אנדותל. מבנים עגולים אחיד הממוקם באזור perinuclear של תאים רבים הם חרוזים מגנטיים המשמשים לבידוד MLEC. (ב) האנדותל ספציפי VE-cadherin הוא מקומי על תאים תאים צמתים כפי שמוצג באמצעות מיקרוסקופיה confocal. בר הוא נציג של 20μm.
איור 2 ניתוח FACS של MLECs תרבותי שכותרתו עם נוגדנים ספציפיים עבור אנדותל הסמנים הספציפיים:. VE-cadherin (CD144) או VEGFR2, הוגש נגדו כתב אישום כמו, ואחריו נוגדן phycoerythrin-מצומדות משנית, מאשרת זהות אנדותל של MLECs מבודדים. הקו האדום מציין אלוטיפ ספציפי שליטה, הקו הירוק מציין VE אנטי-cadherin או אנטי VEGFR2 - ספציפי-IgG.
Discussion
כלי הדם ECS הוכיחו להיות מודל שימושי בתחומים רבים של הביולוגיה כלי הדם הם האמינו להיות יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ללמוד (אנגיוגנזה למשל) מאשר HUVECs למד נרחב 3. בעבר, זה כבר דיווחו כי כלי הדם ECS ניתן להשיג, כליות רקמת לב, שומן, עור הרשתית, מוח, גליומות, וגם ריאה 2, 4-7, 10, 11. עם זאת, שיטה עקבית ואמינה הבידוד של כלי הדם ECS עדיין נדרשת. הנוהל המובא כאן הוא שינוי של הפרוטוקול שפורסם בעבר 2, זה שונה נהלים פרסם ביותר כי היא משתמשת במקום גורים של בעלי חיים מבוגרים. זה חיוני להצלחת בידוד כמו תאים מבעלי חיים צעירים בעלי פוטנציאל גבוה יותר ריבוי תרבויות שמקורם ברקמות שלהם נוטים להניב מספר גבוה יותר של תאים. אחת החיות בשבוע הישן נראה אופטימלי, אבל עכברים צעירים (4 בן יומו) יכול לשמש גם. כמו כן, מספר גבוה או נמוך של הגורים יכולה לשמש אם נדרש, כפי שאנו הצליחו לבודד MLECs מאחד הסיירים. עם זאת, בעוד דרוג כלפי מעלה או מטה את תהליך הבידוד, ציפוי צפיפות התאים חייב להישאר ללא שינוי, כמו זה גם קריטי עבור התפשטות תאים. תהליך צעד 2-טיהור MLECs באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדות הראשון נגד PECAM-1 ו מאשר אנטי ICAM-2 נוגדנים הוא הרבה יותר יעיל בהשגת טהור תרבויות EC מאשר אחד צעד את התהליכים שתוארו לעיל טיהור. פרוטוקול זה מבטל את הצורך להשתמש בטכניקות ידני מייגע מאוד, צנטריפוגה שיפוע FACS פחות יעיל מיון עבור תאים השלכת מזהמים כגון fibroblasts, כדוריות דם ותאי שריר חלק. האוכלוסייה MLEC וכתוצאה מכך ניתן להשתמש בניתוח מבחנה של תגובות angiogenic, חדירות כלי הדם גלגול ליקוציט, ריפוי פצעים, כמו גם ניתוח ביוכימי של מסלולי איתות. במידת הצורך, ניתן MLECs מצופה על גבי משטחים שונים כגון coverslips פיברונקטין או ג'לטין מצופה עבור מערכים immunofluorescence או אלקטרודה עבור טרנס האנדותל (TER) מדידות של התנגדות. התוצאות המתקבלות ניתן להשוות ישירות פנוטיפים נצפתה in vivo, אשר חשוב במיוחד בהקשר של מספר גדל והולך של נוקאאוט קווי עכבר מהונדס. יישום מוצלח של השיטה עבור בניתוח מבחנה של מנגנוני הסלולר הבסיסית פגמים נצפתה in vivo, כבר הציגה 12.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית הספר לרפואה של ויסקונסין IACUC ועדת תחת פרוטוקול AUA # 00001206.
Acknowledgments
מחקר זה מומן בחלקו על ידי איגוד הלב האמריקני להעניק 0950118G.to MC-W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Maruyama, Y. The human endothelial cell in tissue culture. Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).
- Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circ Res. 100, 158-173 (2007).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).
- Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).
- Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).
- Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues. J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).
- Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).
- Zachary, I., Gliki, G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).
- Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization. Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).
- Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice. Blood. 111, 2647-2656 (2008).
