Summary
Aquí se describe un protocolo para el aislamiento y cultivo de las células endoteliales murinas pulmonar. Este método consiste en la disociación mecánica y enzimática del tejido pulmonar, así como un proceso de purificación de 2 pasos con anti-PECAM-1 y anti-ICAM-2 anticuerpos conjugados a perlas magnéticas, lo que produce una población pura de células endoteliales microvasculares su mayoría de origen.
Abstract
Las células endoteliales proporcionar un modelo de investigación útil en muchas áreas de la biología vascular. Desde su primer aislamiento 1, las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC) han demostrado que son convenientes, fáciles de obtener y la cultura, y por lo tanto son las células más estudiadas endoteliales. Sin embargo, la investigación se centró en los procesos como los demás la angiogénesis, la permeabilidad o muchos, las células endoteliales microvasculares (EC) es un modelo mucho más fisiológicamente relevantes para el estudio 2. Por otra parte, los CE aislado de ratones knock-out proporcionar una herramienta útil para el análisis de la ex vivo función de las proteínas. Varios métodos para aislar y microvascular cultura EC de origen diferentes han sido reportados hasta la fecha 3-7, pero el aislamiento constante y la cultura de la pura EC sigue siendo un gran problema técnico en muchos laboratorios. Aquí, ofrecemos un protocolo de paso a paso en un método fiable y relativamente fácil de aislar y cultivar células de los pulmones del ratón endotelial (MLECs). En este enfoque, el tejido pulmonar obtenido a partir de 6 - a 8 días de edad los cachorros primero se corta en pedazos, digeridos con colagenasa / dispasa (C / D) y la solución dispersa mecánicamente en una sola célula de la suspensión. MLECS se purificó a partir de la suspensión celular mediante la selección positiva con anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado con Dynabeads utilizando un concentrador de partículas magnéticas (MPC). Tales células purificadas se cultivan en cultivo de tejidos recubiertos de gelatina (TC) los platos hasta que se hacen confluentes. En ese momento, las células se purifica utilizando Dynabeads junto a anti-ICAM-2 de anticuerpos. MLECs obtenidos con este protocolo muestran un fenotipo de adoquín, como se visualiza mediante microscopía óptica de contraste de fase, y su fenotipo endotelial ha sido confirmado mediante análisis de FACS con anticuerpos anti-VE-cadherina 8 y 9 VEGFR2 anti-anticuerpos y la tinción de inmunofluorescencia de VE-cadherina. En nuestras manos, este procedimiento de aislamiento de dos etapas consistente y fiable rendimiento de una población pura de MLECs, que puede ser más culta. Este método permitirá a los investigadores para aprovechar el creciente número de eliminatorias y ratones transgénicos que se correlacionan directamente en estudios in vivo con los resultados de los experimentos in vitro realizados en MLECs aisladas y por lo tanto ayudar a revelar los mecanismos moleculares de los fenotipos vasculares observados en vivo.
Protocol
1. La preparación de partículas magnéticas anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado (Dynabeads)
- Prepare un 0,1% de BSA en PBS mediante la mezcla de 50 mg de BSA en 50 ml de PBS con un agitar hasta BSA se disuelve. Esterilizar por filtración a través de filtro de 0,22 micras jeringa. Almacenar a 4 ° C.
- En la capilla de cooperación técnica, transferencia de 200 l de bien resuspendido de oveja anti-ratón IgG Dynabeads en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y lavar los granos: el tubo de montaje en la MPC y deje reposar durante 1 minuto para permitir que los granos de sedimento. Aspirar el sobrenadante, retire el tubo de MPC y volver a suspender las bolas en 1 ml de agua estéril 0,1% de BSA / PBS. Pipeta de arriba y abajo para volver a suspender las bolas.
- Repetir el lavado tres veces más, para un total de cuatro lavados.
- Sacar el tubo del MPC y volver a suspender las bolas en 500 l de 0,1% de BSA / PBS.
- Añadir 10 l de rata anti-ratón de PECAM-1 (CD-31) del anticuerpo en el tubo.
- Caída la noche a 4 ° C en la cámara frigorífica o 2 horas a temperatura ambiente.
- Lavar los granos con agua estéril 0,1% de BSA / PBS como se describe en el paso 1.2 en cuatro ocasiones.
- Sacar el tubo del MPC y volver a suspender las bolas en 200 l 0,1% de BSA / PBS. Tienda anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado con Dynabeads a 4 ° C durante un máximo de un mes.
2. Aislamiento de ratón las células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos
Antes de proceder con el protocolo de purificación de los tejidos, IACUC aprobación del Comité del procedimiento es necesario.
- Prepare las siguientes:
- 15 ml de 1 mg / ml C / D solución en DMEM. Filtro con filtro de 0,22 micras jeringa y calentar a 37 º C.
- Tubo de 50 ml cónicos con 15 ml de DMEM, almacenar en el hielo
- Aislamiento de los medios de comunicación (mensajería instantánea), que contiene 20% de SFB y la penicilina 1x / estreptomicina en DMEM
- 2% de gelatina. Mezcla de 2 g de piel de bovino de gelatina con 100 ml de agua dd, minuto 15 autoclave y almacenar a 4 ° C. Calentar a 37 ° C para licuar antes de pintar frascos TC.
- Anestesiar a tres crías de 6-8 días de edad con una inyección ip de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Comprobar la efectividad de la anestesia y la disección de los animales uno por uno, de la siguiente manera: Pin cachorros a bordo, empape la piel con etanol 70% y eliminar la piel de la zona del pecho con unas tijeras de disección estéril. Impuestos Especiales de la caja torácica para exponer los pulmones.
- Lóbulos individuales asépticamente especial de pulmón, teniendo cuidado de no analizar los bronquios y los tejidos conectivos visible alrededor de los pulmones. Combine todos los pulmones en helado de DMEM. La eutanasia a los cachorros.
- De trabajo en la campana TC, remueva los lóbulos pulmonares de DMEM, el lugar en un plato de 100 mm TC y aspirar el exceso de DMEM.
- Utilizando tijeras estériles, carne picada finamente el tejido mediante la reducción de ~ 100 veces. Traslado a 15 ml caliente C / D solución para la digestión enzimática. Incubar 45 minutos a 37 ° C en un rotor.
- En la capilla TC, aspirar la suspensión de tejidos digeridos en una jeringa de 20 ml con 14 g grupos cánula unida y triturar en una suspensión de células individuales, por lo menos 12 veces.
- Pase la suspensión de tejido a través de un filtro de 70 micras de células y lavar el filtro con 15 ml de mensajería instantánea para detener la digestión.
- Pellet suspensión de células por centrifugación a 400x g durante 5 minutos.
- Aspirar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 3 ml de 0,1% de BSA / PBS.
- Transferencia de suspensión de células a 5 ml tubo de poliestireno de fondo redondo y añadir 22,5 l anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado-Dynabeads. Caída en la temperatura ambiente durante 12 minutos.
- Cubra un frasco T75 con 2 ml de 2% de gelatina y el exceso de aspirado de gelatina. Permita que la gelatina seca en su interior la capilla TC durante unos 30 minutos antes de las células de revestimiento.
- Después de la incubación de cuentas es completa (paso 2,10), dividir la suspensión de células por igual en tres tubos Eppendorf y se montan en el MPC.
- Cuando las cuentas se han sedimentado con el MPC (~ 1 minuto), recoger el líquido sobrenadante, retire el tubo de la MPC, lavar los granos con aproximadamente 1 ml 0,1% de BSA / PBS, y volver a montar en el MPC.
- Repetir el lavado cuatro veces (un total de 5 lavados)
- Cuentas resuspender en 1 ml de VascuLife con ENG-Mv vida Factores de Kit y 1 de penicilina / estreptomicina (VL) por tubo, se mezcla bien.
- Placa en una pre-recubiertos T75 frasco y alcanzar un volumen total en cada frasco de 10 ml a la LV.
- Cambiar los medios de comunicación al día siguiente, deje un día lleno de crecimiento, y luego cambiar la mitad de los medios de comunicación todos los días. Cuando las células son> 70-80% confluentes o más (por lo general después de 3-4 días de la cultura), que pueden ser ordenados con anti-ICAM-2 Dynabeads.
3. La preparación de anti-ICAM-2-anticuerpo conjugado Dynabeads
- Dynabeads anti-ICAM-2-anticuerpo conjugado se utiliza para purificar las células que han sido seleccionados con anti-PECAM-1 Dynabeads anticuerpos conjugados y cultivaron hasta confluencia. Este procedimiento se realiza como se describe para Dynabeads anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado (1, arriba), excepto que el anti-ratón ICAM-2 (CD-102) del anticuerpo se utiliza en lugar de anti-PECAM-1 anticuerpo.
- Dynabeads anti-ICAM-2-anticuerpo conjugado se puede almacenar a 4 ° C hastaa 1 mes.
4. Clasificación de las células de ratón de pulmón endoteliales con anticuerpos anti-ICAM-2 Dynabeads
- Escudo T75 frasco de cultivo de tejidos con gelatina al 2%.
- Aspirar los medios de comunicación de la confluencia con el T75 frasco con células y lavar con 8 ml de PBS.
- Aspirar PBS, añadir 2 ml al 0,05% de tripsina / EDTA y dejar que las células de quitar (unos 5 minutos). Toque en frascos ligeramente para ayudar a separar.
- Cuando las células se han desprendido, añadir 2 ml IM para inhibir las células de la tripsina y la raspadura de separar las células adherentes restantes. Transferencia de suspensión de células a un tubo de 15 ml y centrifugar durante 5 minutos a 400 veces g.
- Aspirar los medios de comunicación y resuspender el sedimento celular en 2 ml de 0,1% de BSA / PBS.
- Transferir a un 5 ml de poliestireno de fondo redondo de tubo y se añaden 10 l anti-ICAM-2 Dynabeads. Caída por 12 minutos a temperatura ambiente.
- Dividir la suspensión de células en dos tubos de 1,5 ml Eppendorf y se montan en MPC.
- Aspirar el sobrenadante después de cuentas se han adherido durante un minuto. Retire los tubos del MPC y resuspender en cada tubo 1 ml 0,1% de BSA / PBS. Vuelva a colocar el MPC.
- Repetir el lavado cuatro veces (un total de 5 lavados).
- Resuspender cada tubo con 1 ml VL y realizar un recuento de células.
- Células de la placa a 250-350K células por frasco T25 y / o 750K-1 millón de células por frasco T75.
- Alcanzar un volumen de 5 ml VL en frascos T25, y 10 ml en frascos T75.
- Cambiar los medios de comunicación todos los días. Las células pueden ser utilizados para los experimentos en que la cultura llega a cerca del 80% de confluencia, por lo general en 2-3 días.
5. Resultados representante
Normalmente, después de 6-7 días a partir de la preparación inicial de las células, que son capaces de obtener unos 1,2 a 1,5 x 10 6 células endoteliales pulmonares de tres crías de 6-8 días de edad. Células típicos de la pantalla "adoquines" morfología con microscopía de luz y VE-cadherina (CD144) manchas en las uniones célula-célula, que es característico de las células endoteliales (Figura 1). La mayoría de los MLECs expresa VE-cadherina y VEGFR2 como lo demuestra el análisis de FACS (Figura 2). Por lo general, los utilizamos para los experimentos dentro de dos semanas después de la inicial de aislamiento LMCE.
Figura 1. El análisis microscópico de monocapa confluente LMCE. (A) Imagen de microscopía de luz muestra la morfología de las células cultivadas empedradas típicas de las células endoteliales. Uniforme de estructuras redondas ubicadas en la zona perinuclear de las células son muchas las partículas magnéticas utilizadas para el aislamiento LMCE. (B) endotelial específico VE-cadherina se localiza en las uniones célula-célula, como se muestra mediante microscopía confocal. Bar es representante de 20μm.
Figura 2 FACS análisis de MLECs cultivadas con anticuerpos específicos para los marcadores específicos del endotelio:. VE-cadherina (CD144) o VEGFR2, como acusado, seguido por ficoeritrina-anticuerpo secundario conjugado, confirma la identidad del endotelio de MLECs aislados. La línea roja indica isotipo específico de control, la línea verde indica anti-VE-cadherina o anti-VEGFR2 - específicos IgG.
Discussion
Microvascular EC han demostrado ser un modelo útil en muchas áreas de la biología vascular y se cree que son fisiológicamente más relevantes para el estudio (por ejemplo, la angiogénesis) que ampliamente estudiado HUVECs 3. Anteriormente, se ha informado de que microvascular EC se puede obtener de los riñones, el corazón, el tejido adiposo piel, retina, el cerebro, los gliomas, y también de pulmón 2, 4-7, 10, 11. Sin embargo, un método consistente y fiable para el aislamiento de complicaciones microvasculares EC sigue siendo necesaria. El procedimiento que aquí se presenta es una modificación de un protocolo previamente publicado 2, se diferencia de la mayoría de los procedimientos publicados, ya que utiliza los cachorros de animales adultos. Esto es crucial para el éxito de aislamiento como las células de los animales jóvenes tienen un potencial mayor proliferación y cultivos derivados de los tejidos tienden a producir un mayor número de células. Una semana de edad los animales parecen ser óptimo, pero ratones más jóvenes (de un día 4), también se puede utilizar. Además, el número mayor o menor de las crías puede ser utilizado en caso necesario, como hemos tenido éxito en aislar MLECs de un cachorro. Sin embargo, mientras que la escala hacia arriba o hacia abajo el proceso de aislamiento, la densidad celular recubrimiento debe permanecer sin cambios, ya que esto también es fundamental para la proliferación celular. El proceso de purificación de 2 pasos de MLECs usando perlas magnéticas conjugadas primero en anti-PECAM-1 y de anti-ICAM-2 anticuerpos es mucho más eficiente en la obtención de cultivos puros CE de los procedimientos de purificación se ha descrito anteriormente en un solo paso. Este protocolo elimina la necesidad de utilizar técnicas manuales muy laborioso, y centrifugación en gradiente de FACS menos eficientes de ordenación de las células de descartar la contaminación como los fibroblastos, las células sanguíneas y células musculares lisas. La población resultante LMCE se puede utilizar para el análisis in vitro de las respuestas de la angiogénesis, la permeabilidad vascular y la transmigración de leucocitos, cicatrización de heridas, así como el análisis bioquímico de las vías de señalización. Si es necesario, MLECs se puede platear en diferentes superficies, tales como fibronectina cubreobjetos recubiertos de gelatina o por inmunofluorescencia o matrices de electrodos para trans-endotelial de resistencia (TER) mediciones. Resultados obtenidos se pueden comparar directamente con los fenotipos observados en vivo, que es especialmente importante en el contexto de la creciente cantidad de octavos de final y las líneas de ratones transgénicos. La implementación exitosa de este método de análisis in vitro de los mecanismos celulares subyacentes defectos observados en vivo, ya se ha presentado 12.
Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Colegio Médico de Wisconsin IACUC Comité en virtud del protocolo AUA # 00001206.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada en parte por la Asociación Americana del Corazón conceder 0950118G.to MC-W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
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