Summary
在这里，我们描述了一个小鼠肺血管内皮细胞的分离和培养协议。这种方法包括机械和酶的肺组织分解以及2步纯化过程中使用抗PECAM - 1和抗ICAM - 2的抗体结合磁珠，这将产生一个纯粹的原籍大多微血管的内皮细胞的人口。
Abstract
内皮细胞在血管生物学的许多领域提供了有益的研究模型。自第一次隔离1，人脐静脉内皮细胞（内皮细胞）要方便，容易获得和文化，因此是研究最广泛的内皮细胞。然而，对于重点研究的血管生成，透气性好或许多其他的进程上，微血管内皮细胞（ECS）是一个更有关生理模型 ，研究2。此外，内皮细胞基因敲除小鼠分离蛋白质功能的体外分析提供了一个有用的工具。几种方法来隔离和文化微血管内皮细胞对不同产地已上报日期3-7，但一致的纯内皮细胞的分离和文化仍然是一个在许多实验室的主要技术问题。在这里，我们提供一个可靠和相对简单的方法分离和培养小鼠肺血管内皮细胞（MLECs）一步一步的协议。在这种方法中，肺组织6 - 8岁的幼崽首次切成片，与胶原酶/ dispase（C / D）解决方案，消化和分散成单细胞悬液机械一天。 MLECS纯化细胞悬液，使用抗PECAM - 1抗体结合使用磁粉集中器（MPC）的磁珠阳性选择。这种纯化的细胞培养明胶涂层的组织培养（TC）菜，直到他们成为融合。在这一点上，细胞进一步纯化，再加上以抗ICAM - 2抗体的磁珠。本议定书获得MLECs展示一个鹅卵石的表型，相衬光学显微镜观察，并已被证实使用反VE - cadherin的8和抗VEGFR2的抗体和VE - cadherin的免疫荧光染色流式细胞仪分析其内皮细胞表型。在我们手中，这两个步骤的分离过程中稳定，可靠的收益率的MLECs纯粹的人口，这可以进一步培养。这种方法使研究人员利用基因敲除和转基因小鼠体内研究直接相关，在对孤立MLECs 进行的体外实验结果越来越多的优势， 从而有助于揭示体内观察到的血管表型的分子机制。
Protocol
1。准备抗PECAM - 1抗体偶联的磁珠（磁珠）
- 准备通过使用一个旋涡，直到BSA溶解，混合在50毫升PBS 50毫克BSA的0.1％牛血清白蛋白的PBS。 0.22微米注射器过滤器过滤消毒。保存在4 ° C。
- 在TC罩，转移到1.5 mL Eppendorf管200μL重悬羊抗鼠IgG磁珠，洗珠：山管货币政策委员会，并让坐珠，让泥沙约1分钟。吸上清，去除MPC管和1毫升无菌0.1％BSA / PBS重悬珠。移液器向上和向下重悬珠。
- 重复洗三次，共有四个清洗。
- 删除MPC管和500微升0.1％BSA / PBS重悬珠。
- 管中加入10μL大鼠抗小鼠PECAM - 1（CD - 31）抗体。
- 翻滚在寒冷的房间或在室温下2小时，在4 ° C过夜。
- 用无菌0.1％BSA / PBS清洗珠如在步骤1.2四次中所述。
- 删除MPC管和200微升0.1％BSA / PBS重悬珠。商店抗PECAM - 1抗体偶联的磁珠在4 °长达1个月的彗星。
2。隔离鼠标从新生小鼠肺血管内皮细胞
继续组织净化协议之前，IACUC委员会的批准程序是必需的。
- 准备好以下几点：
- 15毫升1毫克/毫升C / D DMEM液。过滤用0.22微米注射器过滤器和加热到37 ° C。
- 50 ml锥形管15毫升的DMEM，储存在冰
- 分离介质（IM），含20％胎牛血清和1x青霉素/链霉素的DMEM
- 2％的明胶。混合2克牛皮肤明胶日水100毫升，高压灭菌15分钟，并储存于4 ° C。暖至37 ° C液化涂装前TC烧瓶。
- 麻醉三个6-8天使用注射氯胺酮（100毫克/公斤）和甲苯噻嗪（10毫克/公斤）的IP岁的幼崽。麻醉效果，并解剖动物逐一检查，如下：板引脚的幼崽，用70％乙醇浸泡的皮肤和去除胸部皮肤，用无菌剥离剪刀。海关暴露肺部肋骨。
- 无菌消费个体肺癌的肺叶，小心不要解剖任何可见支气管和肺部周围的结缔组织。结合在冰冷的DMEM所有肺部。安乐死的幼崽。
- 工作训练班罩，肺部肺叶和删除的DMEM，在100毫米训练班菜的地方，吸出多余的DMEM。
- 使用无菌剪刀，肉组织精细切割〜100倍。转移至15毫升暖C / D酶消化解决方案。在37 ° C孵育45分钟，一个肩。
- 在TC发动机罩，吸14克导管连接和磨碎成单细胞悬液的团块，至少有12次到20毫升注射器消化的组织悬液。
- 穿过70微米的细胞过滤器组织悬液，用15毫升的IM过滤器停止消化。
- 颗粒细胞悬液，离心5分钟400X克。
- 吸上清，重新悬浮颗粒在3毫升0.1％的BSA / PBS。
- 将细胞悬液5 ml圆底聚苯乙烯管，并添加22.5μL抗PECAM - 1抗体偶联的磁珠。翻滚在室温为12分钟。
- 外套与T75烧瓶2 mL 2％的明胶和吸出多余的明胶。允许明胶训练班罩内的干燥约30分钟前电镀细胞。
- 珠孵化完成后，（步长2.10），分裂细胞悬液分为3个Eppendorf管，并安装在MPC的。
- 当珠使用MPC（〜1分钟）沉淀，收集上清，去除MPC管，洗珠〜1毫升0.1％的BSA / PBS，然后重新安装的MPC。
- 重复洗四次（共5洗）
- 重悬珠EnGS - MV寿命的因素套件和1x青霉素/链霉素（VL），每管1毫升VascuLife，搅拌好。
- T75烧瓶中，预涂层钢板，并在每个烧瓶中带来的总体积至10毫升与VL。
- 更改媒体翌日，允许增长1整天，然后更改隔日媒体的一半。当细胞> 70％-80％汇合或多个（通常在3-4天的文化），他们可以与抗ICAM - 2磁珠进行排序。
3。准备抗ICAM - 2的抗体偶联的磁珠
- 抗ICAM - 2的抗体偶联的磁珠用于进一步净化抗PECAM - 1抗体偶联的磁珠和培养，直到融合已选定的单元格。抗PECAM - 1抗体偶联的磁珠（1段）所述，除，抗小鼠ICAM - 2（CD - 102）抗体用于抗PECAM - 1抗体，而不是执行此过程。
- 抗ICAM - 2的抗体偶联的磁珠在4 ° C，最多可存储1个月。
4。排序小鼠肺血管内皮细胞与抗ICAM - 2磁珠
- 大衣T75组织2％明胶的培养瓶中。
- 吸媒体与细胞融合T75烧瓶，用8毫升PBS。
- 吸PBS中，加2毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA，让细胞分离（约5分钟）。轻轻点击烧瓶，以帮助分离。
- 当细胞分离，加入2 ml的IM抑制胰蛋白酶和刮细胞分离任何剩余的贴壁细胞。将细胞悬液15毫升管和自旋为5分钟400X G.
- 在2毫升0.1％的BSA / PBS吸媒体和重悬细胞沉淀。
- 转移到5毫升的聚苯乙烯圆底管，添加10μL抗ICAM - 2磁珠。翻滚在室温为12分钟。
- 拆分成两个1.5 ml Eppendorf管中，并装入MPC细胞悬液。
- 珠坚持一分钟后，吸上清液。删除MPC管，每管1毫升0.1％的BSA / PBS重悬。重新装入对货币政策委员会。
- 重复洗4次（共5洗）。
- 重悬每管1毫升VL，并进行细胞计数。
- 在250 - 350K电池板每T25烧瓶和/或750K - 1万个细胞T75烧瓶细胞。
- 带量5毫升VL的T25烧瓶中，在T75烧瓶和10毫升。
- 更改媒体隔日。文化达到约80％汇合，通常在2-3天，的细胞可用于实验。
5。代表性的成果
通常情况下，从细胞的前期准备工作后6-7天，我们能够获得约1.2 - 1.5 × 10 6从三个6-8日龄仔兔肺血管内皮细胞。细胞显示典型的“鹅卵石”形态和光镜下显示的VE -钙粘蛋白（CD144）在细胞与细胞交界处的染色，这是对内皮细胞的特征（图1）。 MLECs表达VE - cadherin和VEGFR2的大部分证明用流式细胞仪分析（图2）。通常，我们使用后在两个星期内的实验，他们最初的“电子商务示范法”第隔离。
图1。微观分析融合“电子商务示范法”第单层。 （一）光学显微镜图像显示了典型的内皮细胞培养的细胞形态的鹅卵石。在许多细胞的核周区位于统一一轮结构“电子商务示范法”第隔离使用的磁珠。 （二）使用共聚焦显微镜所显示的细胞 - 细胞连接处的内皮具体的VE - cadherin的本地化。酒吧是20μm的代表。
图2流式细胞仪的标记抗体对内皮细胞的特异性标志特定的培养MLECs 分析 ：VE -钙粘蛋白（CD144）或VEGFR2的，如被起诉，藻红蛋白标记的二抗，内皮身份确认孤立MLECs 。红线表示亚型具体的控制，绿线表示反VE - cadherin的或抗VEGFR2的 - 特定抗体。
Discussion
微血管内皮细胞已被证明是一个有用的模型在血管生物学的许多领域，被认为是有关生理研究比 3脐静脉内皮细胞广泛的研究（如血管） 。此前，有报道，微血管内皮细胞可以从肾脏，心脏，皮肤，视网膜，脑，神经胶质瘤，脂肪组织和肺2，4-7，10，11获得。然而，微血管内皮细胞的隔离的一致和可靠的方法仍然是必需的。这里介绍的程序是以前发布的协议2的修改;从最公布的程序，它使用了幼崽，而不是成年动物的不同。这是隔离成功的关键，年轻动物的细胞有较高的增殖潜能和来自其组织的文化，往往会产生较高的细胞数量。一个星期的动物似乎是最佳的，但年轻的老鼠（4日龄）也可以使用。此外，可以使用较高或较低的幼崽，如果需要的话，因为我们已经成功隔离MLECs从一个小狗。然而，同时缩放向上或向下的隔离过程中，细胞电镀密度必须保持不变，因为这也是细胞增殖的关键。首先使用共轭磁珠抗PECAM - 1和抗ICAM - 2的抗体比MLECs 2步纯化过程，是更有效的获得纯EC比前面描述的单步纯化过程文化。此协议消除了需要使用很费力的手工技术，梯度离心法和分类丢弃污染的细胞，如成纤维细胞，血细胞和平滑肌细胞的效率较低，流式细胞仪。 MLEC人口所产生的可用于在体外培养的血管生成响应，血管通透性和白细胞轮回分析，伤口愈合以及信号转导通路的生化分析。如果需要，MLECs可镀上不同的表面，如免疫或跨内皮电阻（TER）测量电极阵列的纤维连接蛋白或明胶包被的盖玻片。可以直接得到的结果相比， 在体内 ，这一点特别重要，在越来越多的基因敲除和转基因小鼠线背景下观察到的表型。成功地实施这种方法，在体外体内观察到的缺陷的细胞机制的分析，已提出12。
Disclosures
动物实验是由威斯康星IACUC委员会根据协议AUA＃00001206医学院规定的准则和法规的规定执行。
Acknowledgments
这项研究是由美国心脏协会授予0950118G.to MC - W支持部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
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