Summary
We beschrijven hier een protocol voor het kweken van muizen pulmonale endotheelcellen. Deze methode bestaat uit mechanische en enzymatische longweefsel dissociatie evenals een 2-staps zuiveringsproces met behulp van anti-PECAM-1 en anti-ICAM-2 antilichamen geconjugeerd aan magnetische korrels, die een pure endotheelcellen bevolking van voornamelijk microvasculaire oorsprong produceert.
Abstract
Endotheelcellen een nuttige onderzoeksmodel in veel gebieden van de vasculaire biologie. Sinds zijn eerste isolatie 1, hebben menselijke navelstreng endotheel cellen (HUVEC) laten zien dat handig zijn, gemakkelijk te verkrijgen en cultuur, en dus zijn de meest bestudeerde endotheelcellen. Echter, voor onderzoek gericht op processen, zoals angiogenese, doorlaatbaarheid of vele anderen, microvasculaire endotheelcellen (EC) is een veel meer fysiologisch relevante model 2-studie. Bovendien, EC geïsoleerd van knock-out muizen bieden een nuttig instrument voor de analyse van eiwitfunctie ex vivo. Verschillende benaderingen te isoleren en de cultuur microvasculaire EC van verschillende herkomst is gemeld dat de datum 3-7, maar consistent isolatie en de cultuur van pure EC is nog steeds een groot technisch probleem in veel laboratoria. Hier bieden wij een stap-voor-stap protocol op een betrouwbare en relatief eenvoudige methode van isoleren en kweken van muizen long endotheelcellen (MLECs). In deze benadering, longweefsel verkregen van 6 - tot 8-dagen oude pups eerste is in stukken gesneden, gedigereerd met collagenase / dispase (C / D)-oplossing en verspreid mechanisch in de single-celsuspensie. MLECS worden gezuiverd van de celsuspensie met behulp van positieve selectie met anti-PECAM-1 antilichaam geconjugeerd aan Dynabeads met behulp van een Magnetic Particle Concentrator (MPC). Dergelijke gezuiverde cellen worden gekweekt op gelatine gecoate weefselkweek (TC) gerechten totdat ze confluent. Op dat moment worden de cellen verder worden gezuiverd met behulp van Dynabeads gekoppeld aan anti-ICAM-2 antilichaam. MLECs verkregen met dit protocol vertonen een geplaveide fenotype, zoals gevisualiseerd door fase-contrast lichtmicroscopie, en hun endotheel fenotype is bevestigd met behulp van FACS-analyse met anti-VE-cadherine 8 en anti-VEGFR2 9 antilichamen en immunofluorescentie kleuring van VE-cadherine. In onze handen, deze twee-staps procedure isolatie consistente en betrouwbare wijze levert een zuivere populatie van MLECs, die kan worden verder gekweekt. Deze methode zal onderzoekers in staat om te profiteren van het groeiend aantal knock-out en transgene muizen om direct in vivo studies correleren met de resultaten van in vitro experimenten uitgevoerd op geïsoleerde MLECs en zo moleculaire mechanismen van vasculaire fenotypes waargenomen in vivo zichtbaar te helpen.
Protocol
1. Voorbereiden van anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerd magnetische korrels (Dynabeads)
- Bereid 0,1% BSA in PBS door het mengen van 50 mg BSA in 50 ml PBS met behulp van een vortex tot BSA oplost. Steriliseren in gefilterd door 0.22 urn spuitfilter. Bewaren bij 4 ° C.
- In de TC kap, overdracht 200 ul van goed geresuspendeerd schapen anti-rat IgG Dynabeads in een 1,5 ml Eppendorf buis en was de kralen: Mount slang op MPC en laat zitten voor ongeveer 1 minuut tot de kralen te laten sediment. Supernatant aspireren, verwijdert u de tube van MPC en resuspendeer de kralen in 1 ml steriele 0,1% BSA / PBS. Pipet op en neer om kralen mengen.
- Herhaal dit was nog drie keer, voor een totaal van vier wasbeurten.
- Verwijder de slang van de MPC en resuspendeer de kralen in 500 pi van 0,1% BSA / PBS.
- Voeg 10 ul rat anti-muis PECAM-1 (CD-31) antilichaam aan de buis.
- Tumble nacht bij 4 ° C in de koude kamer of 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was de kralen met een steriele 0,1% BSA / PBS, zoals beschreven in stap 1.2 vier keer.
- Verwijder de slang van de MPC en resuspendeer de kralen in 200 ul 0,1% BSA / PBS. Store anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand.
2. Isoleren van de muis pulmonale endotheliale cellen van neonatale muizen
Voordat u verdergaat met het weefsel zuivering protocol, is IACUC Comite de goedkeuring van de procedure vereist is.
- Bereid het volgende:
- 15 ml van 1 mg / ml C / D-oplossing in DMEM. Filter met 0,22 urn spuitfilter en warm tot 37 ° C.
- 50 ml conische buis met 15 ml DMEM, op te slaan op het ijs
- Isolatie Media (IM) met 20% FBS en 1x penicilline / streptomycine in DMEM
- 2% gelatine. Mix 2 g runder huid gelatine met 100 ml water dd, autoclaaf 15 minuten en bewaren bij 4 ° C. Warm tot 37 ° C tot vloeibaar te maken voor het coaten TC kolven.
- Verdoven drie 6-8 dagen oude pups met behulp van een IP-injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Controleer op de effectiviteit van de anesthesie en ontleden dieren een voor een, als volgt: Pin pups aan boord, de huid nat met 70% ethanol en verwijder de huid van de borst met een steriel dissectie schaar. Accijnzen de ribbenkast aan de longen bloot te leggen.
- Aseptisch accijnzen individuele longkwabben, zorg dat u de bronchiën en zichtbare bindweefsel rond de longen ontleden. Combineer alle longen in ijskoud DMEM. Laten inslapen van de pups.
- Werken in de TC kap, verwijder longkwabben van DMEM, plaats in een 100 mm TC schotel en zuig overtollige DMEM.
- Met behulp van steriele schaar, fijn gehakt het weefsel door te snijden ~ 100 keer. Transfer naar 15 ml warm C / D-oplossing voor de enzymatische spijsvertering. Incubeer 45 minuten bij 37 ° C op een rotator.
- In de TC kap, zuigen de verteerde weefsel suspensie in een 20 ml spuit met 14 g canule bevestigd en vermaal klonten in een enkele celsuspensie, minstens 12 keer.
- Voorbij het weefsel suspensie door een 70 um cel zeef en spoel het filter met 15 ml IM om de spijsvertering te stoppen.
- Pellet celsuspensie door centrifugeren bij 400x g gedurende 5 minuten.
- Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS.
- Overdracht celsuspensie tot 5 ml met ronde bodem polystyreen reageerbuis en voeg 22,5 pl anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads. Tumble bij kamertemperatuur gedurende 12 minuten.
- Coat een T75 fles met 2 mL 2% gelatine en zuig overtollige gelatine. Laat gelatine op in de TC kap droog gedurende ongeveer 30 minuten voor plating cellen.
- Na de incubatie kraal is voltooid (stap 2,10), split celsuspensie even in drie Eppendorf buizen en monteren op het MPC.
- Wanneer de kralen hebben gesedimenteerd het gebruik van de MPC (~ 1 min), het verzamelen van supernatant, tube van MPC te verwijderen, wassen kralen met ~ 1 ml 0,1% BSA / PBS, en dan opnieuw kunnen mounten op het MPC.
- Herhaal dit was vier maal (totaal vijf wasbeurten)
- Resuspendeer kralen in 1 ml van VascuLife met EnGS-Mv Life Factoren Kit en 1x penicilline / streptomycine (VL) per buis, mengen goed.
- Plaat op een pre-gecoate T75 kolf en brengen het totale volume in elke kolf tot 10 ml met VL.
- Wijzig de media de volgende dag, laat een volledige dag van groei, en wijzigt u vervolgens de helft van de media om de andere dag. Wanneer de cellen worden> 70-80% samenvloeiende of meer (meestal na 3-4 dagen van cultuur), kunnen ze worden gesorteerd met anti-ICAM-2 Dynabeads.
3. Voorbereiden van anti-ICAM-2 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads
- Anti-ICAM-2 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads worden gebruikt om verder te zuiveren cellen die zijn geselecteerd met anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerde Dynabeads en gekweekt tot de samenvloeiing. Deze procedure wordt uitgevoerd zoals beschreven voor anti-PECAM-1 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads (1, boven), behalve dat anti-muis ICAM-2 (CD-102) antilichaam wordt gebruikt in plaats van anti-PECAM-1 antilichaam.
- Anti-ICAM-2 antilichaam-geconjugeerd Dynabeads kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurendetot 1 maand.
4. Sorteren Mouse Lung endotheelcellen met anti-ICAM-2 Dynabeads
- Vacht T75 weefselkweek kolf met 2% gelatine.
- Aspireren de media uit de samenvloeiing T75 fles met cellen en wassen met 8 ml PBS.
- Aspireren PBS, voeg 2 ml 0,05% trypsine / EDTA en laat cellen los (ongeveer 5 minuten). Klop lichtjes op kolven op de steun los.
- Wanneer de cellen zijn vrijstaand, voeg 2 ml IM tot trypsine en schraap cellen remmen om de resterende hechtende cellen los te maken. Overdracht celsuspensie om een 15 ml buis en spin down gedurende 5 min bij 400x g.
- Aspireren van de media en resuspendeer celpellet in 2 ml 0,1% BSA / PBS.
- Transfer naar een 5 ml polystyreen ronde bodem buis en voeg 10 ul anti-ICAM-2 Dynabeads. Tumble gedurende 12 minuten bij RT.
- Splitsen celsuspensie in twee 1,5 ml Eppendorf buizen en monteren op MPC.
- Aspireren supernatant na kralen hebben gehouden voor een minuut. Verwijder de buizen van MPC en resuspendeer elk buisje in 1 ml 0,1% BSA / PBS. Monteer op de MPC.
- Herhaal dit was vier keer (in totaal vijf wasbeurten).
- Resuspendeer elk buisje met 1 ml VL en het uitvoeren van een celgetal.
- Plaat-cellen bij 250-350K cellen per T25 fles en / of 750K-1 miljoen cellen per T75 fles.
- Breng het volume op 5 ml VL in T25 flessen, en 10 ml in T75 kolven.
- Verandering media om de andere dag. Cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten als cultuur bereikt ongeveer 80% confluentie, meestal in 2-3 dagen.
5. Representatieve resultaten
Typisch, na 6-7 dagen na de eerste voorbereiding van de cellen, zijn wij in staat om te verkrijgen over 1,2 tot 1,5 x 10 6 pulmonale endotheelcellen uit drie 6-8 dagen oude pups. Cellen tonen typische "kinderkopjes" morfologie onder lichte microscopie en show VE-cadherine (CD144) kleuring bij cel-cel-juncties, die kenmerkend is voor de endotheelcellen (Figuur 1). Meerderheid van de MLECs express VE-cadherine en VEGFR2 zoals wordt aangetoond door FACS-analyse (figuur 2). Meestal gebruiken we ze voor experimenten binnen twee weken na de eerste MLEC isolatie.
Figuur 1. Microscopische analyse van confluerende MLEC monolaag. (A) Lichtmicroscopie afbeelding toont kasseien morfologie van de gekweekte cellen typisch voor de endotheelcellen. Uniforme ronde structuren gelegen in het perinucleaire gebied van vele cellen zijn de magnetische korrels gebruikt voor MLEC isolatie. (B) endotheliale-specifieke VE-cadherine is gelokaliseerd in de cel-cel verbindingen zoals weergegeven met behulp van confocale microscopie. Bar is vertegenwoordiger van 20μm.
Figuur 2 FACS-analyse van gekweekte MLECs gemerkt met antilichamen die specifiek zijn voor het endotheel-specifieke merkers:. VE-cadherine (CD144) of VEGFR2, zoals aangeklaagd, gevolgd door phycoerythrine-geconjugeerd secundair antilichaam, bevestigt endotheliale identiteit van geïsoleerde MLECs. Rode lijn geeft isotype-specifieke controle, groene lijn geeft aan anti-VE-cadherine of anti-VEGFR2 - specifiek-IgG.
Discussion
Microvasculaire EC hebben bewezen een nuttig model in veel gebieden van de vasculaire biologie worden en worden geacht te zijn fysiologisch relevant zijn voor onderzoek (bv. angiogenese) dan uitgebreid bestudeerd HUVEC 3. Eerder is gemeld dat microvasculaire EC kan worden verkregen bij nier, hart, huid, netvlies, de hersenen, gliomen, vetweefsel en ook long-2, 4-7, 10, 11. Er is echter een consistente en betrouwbare methode voor het isoleren van microvasculaire EC nog nodig. De procedure hier wordt gepresenteerd is een wijziging van een eerder gepubliceerd protocol 2, het verschilt van de meeste gepubliceerde procedures in die zin dat gebruik maakt van pups in plaats van volwassen dieren. Dit is cruciaal voor de isolatie succes als cellen van jonge dieren hebben een hogere proliferatie potentieel en culturen uit hun weefsels hebben de neiging om groter aantal cellen opleveren. Een week oude dieren lijken te zijn optimaal, maar jonger muizen (4 dagen oud) kan ook worden gebruikt. Ook kan hoger of lager aantal pups worden gebruikt indien nodig, zoals we zijn succesvol geweest in het isoleren van MLECs van een pup. Echter, terwijl de schaal omhoog of omlaag de isolatie proces moet cel-plating dichtheid blijven ongewijzigd, aangezien dit ook is van cruciaal belang voor celproliferatie. De 2-staps zuiveringsproces van MLECs met behulp van magnetische beads geconjugeerd eerste anti-PECAM-1 en dan de anti-ICAM-2-antilichamen is veel efficiënter op het verkrijgen van zuivere EG culturen dan de eerder beschreven single-stap zuivering procedures. Dit protocol elimineert de noodzaak om zeer bewerkelijke manuele technieken, gradiënt centrifugatie en minder efficiënt FACS sortering voor het weggooien van besmetting van cellen zoals fibroblasten, bloedcellen en gladde spiercellen te gebruiken. De resulterende MLEC bevolking kan worden gebruikt voor in vitro analyse van angiogene responsen, vasculaire permeabiliteit en leukocyten transmigratie, wondgenezing en biochemische analyse van signaalwegen. Indien gewenst kan MLECs worden uitgeplaat op verschillende ondergronden, zoals fibronectine of gelatine-gecoate dekglaasjes voor immunofluorescentie of electrode-arrays voor trans-endotheliale weerstand (TER) metingen. Behaalde resultaten kunnen direct worden vergeleken met de fenotypes waargenomen in vivo, wat vooral belangrijk is in het kader van het groeiende aantal knock-out en transgene muis lijnen. Succesvolle implementatie van deze methode voor in-vitro analyse van de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan defecten waargenomen in vivo, is al gepresenteerd 12.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Medical College of Wisconsin IACUC comite onder protocol AUA # 00001206 in te stellen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Amerikaanse Heart Association verlenen 0950118G.to MC-W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Maruyama, Y. The human endothelial cell in tissue culture. Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).
- Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circ Res. 100, 158-173 (2007).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).
- Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).
- Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).
- Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues. J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).
- Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).
- Zachary, I., Gliki, G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).
- Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization. Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).
- Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice. Blood. 111, 2647-2656 (2008).
