Summary
Здесь мы опишем протокол для изоляции и культуре мышиных легочных эндотелиальных клеток. Этот метод включает в себя механические и ферментативной диссоциации легочной ткани, а также 2-х ступенчатый процесс очистки с использованием анти-PECAM-1 и анти-ICAM-2 антител, конъюгированных с магнитных бус, который производит чистый эндотелиальной клеточной популяции в основном микрососудистых происхождения.
Abstract
Эндотелиальная клетки обеспечивают полезную модель исследования во многих областях сосудистой биологии. С момента своего первого изоляции 1, пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) показали, чтобы быть удобной, легко получить и культуры, и, следовательно, являются наиболее широко изучается эндотелиальных клеток. Однако, для исследований, направленных на процессы, как ангиогенез, проницаемость и многие другие, микрососудистых эндотелиальных клеток (ECS) являются гораздо более физиологически соответствующие модели для изучения 2. Кроме того, ECS изолированы от нокаутом мышей стать полезным инструментом для анализа белков естественных бывшие функции. Несколько подходов, чтобы изолировать и культуры микрососудистых исполкомов различного происхождения были зарегистрированы на сегодняшний день 3-7, но в соответствии изоляции и культуры чистой этике до сих пор основные технические проблемы во многих лабораториях. Здесь мы предоставляем шаг за шагом, протокол о надежных и относительно простой метод выделения и культивирования мыши легких эндотелиальных клеток (MLECs). При таком подходе, легкие ткани, полученной от 6 - до 8-дневных щенков сначала разрезают на куски, расщепляют коллагеназа / dispase (C / D) решение и разошлись механически в одной клеточной суспензии. MLECS очищают от клеточной суспензии с использованием позитивного выбора с анти-PECAM-1 антител, конъюгированных с Dynabeads использованием магнитных частиц Концентратор (ПДК). Такие очищенные клетки культивируют на желатин покрытием культуре ткани (ТС) блюда, пока они не сливающийся. В этот момент клетки дополнительно очищают использованием Dynabeads связан с анти-ICAM-2 антител. MLECs, полученные с применением протокола выставку булыжником фенотип, как визуализируются с помощью фазово-контрастной световой микроскопии, а также их эндотелия фенотип была подтверждена с помощью анализа FACS с анти-VE-кадгерина 8 и анти-VEGFR2 9 антител и иммунофлуоресцентного окрашивания VE-кадгерина. В наших руках, это двухступенчатая процедура изоляции последовательно и надежно дает чистый населения MLECs, которые могут быть дополнительно культурно. Этот метод позволит исследователям, чтобы воспользоваться растущим числом нокаутом и трансгенных мышах, чтобы прямо коррелируют в естественных условиях исследования с результатами в пробирке эксперименты на изолированных MLECs и тем самым помогают выявить молекулярные механизмы сосудистой фенотипы наблюдается в естественных условиях.
Protocol
1. Подготовка по борьбе с PECAM-1 антител, конъюгированных магнитных шариков (Dynabeads)
- Подготовка 0,1% БСА в ФСБ, смешивая 50 мг BSA в 50 мл PBS использованием вихревой до BSA растворяется. Стерилизовать фильтрованием через фильтр 0,22 мкм шприц. Хранить при температуре 4 ° С.
- В капоте ТС, передача 200 мкл и ресуспендировали овец анти-IgG крысы Dynabeads в 1,5 мл трубки Эппендорфа и мыть бисером: Гора трубки на MPC и дайте постоять около 1 минуты, чтобы бусы осадка. Аспирируйте супернатант, удалить трубку из MPC и ресуспендируйте бисером в 1 мл стерильного 0,1% BSA / PBS. Внесите вверх и вниз для ресуспендирования бисером.
- Повторите мыть еще три раза, в общей сложности из четырех стирок.
- Удалите трубку от MPC и ресуспендируйте бисером в 500 мкл 0,1% BSA / PBS.
- Добавьте 10 мкл крысы антимышиным PECAM-1 (CD-31) антител к трубе.
- Tumble течение ночи при 4 ° С в холодное помещение или 2 часа при комнатной температуре.
- Вымойте бисером стерильным 0,1% BSA / PBS, как описано в шаге 1,2 четыре раза.
- Удалите трубку от MPC и ресуспендируйте бисером в 200 мкл 0,1% BSA / PBS. Магазин анти-PECAM-1 антител, конъюгированных Dynabeads при 4 ° С в течение 1 месяца.
2. Изоляция мыши легочные эндотелиальные клетки от новорожденных мышей
Перед продолжением протокола очистки ткани, IACUC комитета утверждении порядка не требуется.
- Подготовьте следующее:
- 15 мл 1 мг / мл C / D решение в DMEM. Фильтр с 0,22 мкм фильтр шприца и теплой до 37 ° C.
- 50 мл коническую трубку с 15 мл DMEM, хранить на льду
- Изоляция Media (IM), содержащей 20% FBS и 1x пенициллина / стрептомицина в DMEM
- 2% желатина. Смешать 2 г желатина бычьей кожи с 100 мл воды дд, автоклав 15 минут и хранят при температуре 4 ° C. Нагреть до 37 ° C для разжижения перед нанесением покрытия колбы ТС.
- Обезболить три 6-8 дневных щенков использованием IP-инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Проверить эффективность анестезии и препарировать животных одного за другим, а именно: Pin щенков на борт, смочите кожу с 70% этанола и снимите кожу от области груди стерильными ножницами рассечение. Акцизный грудной клетки подвергать легких.
- Асептических условиях акцизный отдельных долей легких, стараясь не препарировать бронхов и без видимых соединительной ткани вокруг легких. Смешайте все легкие в ледяной DMEM. Эвтаназии щенков.
- Работа в капоте ТС, удалить легких долях от DMEM, место в 100 мм блюдо ТС и аспирации избыточного DMEM.
- Использование стерильных ножниц, фарша мелко ткани за счет сокращения ~ 100 раз. Трансфер в 15 мл теплой C / D решения для ферментативного пищеварения. Инкубировать 45 минут при 37 ° С на ротатора.
- В капоте ТС, аспирация переваривается ткани для суспензии в 20 мл шприц с 14 г канюли прилагается и растирают сгустки в суспензии отдельных клеток, по крайней мере 12 раз.
- Pass ткани суспензии через сито 70 мкм клетка и промыть фильтр с 15 мл IM, чтобы остановить пищеварения.
- Гранул суспензии клеток путем центрифугирования при 400x г в течение 5 минут.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл 0,1% BSA / PBS.
- Передача клеточной суспензии по 5 мл с круглым дном полистирола трубки и добавьте 22,5 мкл анти-PECAM-1 антител, конъюгированных Dynabeads. Tumble при комнатной температуре в течение 12 минут.
- Пальто T75 колбе с 2 мл 2% желатина и аспирации избыточного желатин. Разрешить желатин сухой внутри капота ТС в течение примерно 30 минут до покрытия клеток.
- После инкубации бусина является полным (шаг 2,10), сплит-клеточной суспензии поровну на три пробирки Эппендорф и смонтировать на ПДК.
- Когда бисера осевших использовании ПДК (~ 1 мин), собирают супернатант, удалить трубку из MPC, мыть бисер с ~ 1 мл 0,1% BSA / PBS, а затем установите на ПДК.
- Повторите мыть в четыре раза (всего 5 промывок)
- Ресуспендируют бисером в 1 мл VascuLife с EnGS-Му Жизнь Факторы Kit и 1x пенициллина / стрептомицина (ВЛ) на пробирку, замешивая хорошо.
- Пластина на предварительно покрытых T75 колбу и довести общий объем в каждой колбе до 10 мл VL.
- Изменение средств массовой информации на следующий день, позволяют 1 полный день роста, а затем изменить половины средств массовой информации каждый день. Когда клетки> 70-80% сливной или более (обычно через 3-4 дней культуры), они могут быть отсортированы с анти-ICAM-2 Dynabeads.
3. Подготовка анти-ICAM-2 антител, конъюгированных Dynabeads
- Анти-ICAM-2 антител, конъюгированных Dynabeads используются для дальнейшей очистки клетки, которые были выбраны с анти-PECAM-1 антител, конъюгированных Dynabeads и культурной пока сливной. Эта процедура выполняется, как описано для анти-PECAM-1 антител, конъюгированных Dynabeads (1, выше), за исключением того, что анти-мышь ICAM-2 (CD-102) антител используется вместо анти-PECAM-1 антител.
- Анти-ICAM-2 антител, конъюгированных Dynabeads можно хранить при температуре 4 ° С додо 1 месяца.
4. Сортировка Мышь легких эндотелиальные клетки с анти-ICAM-2 Dynabeads
- Пальто T75 культуре ткани колбе с 2% желатина.
- Аспирируйте средств массовой информации из сливной T75 колбы с клетками и промыть 8 мл PBS.
- Аспирируйте PBS, добавьте 2 мл 0,05% трипсин / ЭДТА и пусть клетки отделяются (около 5 минут). Нажмите колбы слегка, чтобы помочь отсоединение.
- Когда клетки имеют отдельные, добавьте 2 мл IM ингибировать трипсин и очистить клетки отделить все оставшиеся прилипшие клетки. Передача клеточной суспензии в 15 мл трубки и со спином вниз в течение 5 мин при 400x г.
- Аспирируйте СМИ и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл 0,1% BSA / PBS.
- Трансфер в 5 мл полистирола с круглым дном трубки и добавить 10 мкл анти-ICAM-2 Dynabeads. Tumble в течение 12 минут при комнатной температуре.
- Сплит клеточной суспензии на два 1,5 мл Eppendorf труб и монтировать на ПДК.
- Аспирируйте супернатант после бисером придерживались в течение одной минуты. Удалить труб из MPC и ресуспендируют каждую пробирку по 1 мл 0,1% BSA / PBS. Перемонтировать на ПДК.
- Повторите мыть в четыре раза (всего 5 промывок).
- Ресуспендируют каждую пробирку с 1 мл В.Л. и выполнять клеток.
- Пластина клетки при 250-350K клеток на T25 колбу и / или 750 тыс.-1 млн. клеток на T75 колбу.
- Довести объем до 5 мл Л. T25 в колбах и 10 мл в колбы T75.
- Изменение средств массовой информации каждый день. Клетки могут быть использованы для экспериментов, когда культура достигает около 80% слияния, как правило, через 2-3 дня.
5. Представитель Результаты
Как правило, после 6-7 дней с момента первоначальной подготовке клеток, мы сможем получить около 1,2 - 1,5 х 10 6 легочных эндотелиальных клеток из трех 6-8 дневных щенков. Клетки дисплей типичный "булыжник" морфологии при световой микроскопии и шоу-VE-кадгерина (CD144) окрашивание в межклеточных контактов, что характерно для клеток эндотелия (рис. 1). Большинство MLECs выразить VE-кадгерина и VEGFR2 о чем свидетельствует FACS анализ (рис. 2). Как правило, мы используем их для экспериментов в течение двух недель после первой изоляции ТЗЭТ.
Рисунок 1. Микроскопический анализ сливающийся монослой ТЗЭТ. () Легкий образ микроскопия показывает булыжником морфология культивируемых клеток характерно для клеток эндотелия. Равномерное круглых строений, находящихся в перинуклеарные области многие клетки магнитных гранул используется для изоляции ТЗЭТ. (B) Эндотелиальная конкретных VE-кадгерина локализована на межклеточных контактов, как показано с помощью конфокальной микроскопии. Бар представитель 20 мкм.
Рисунок 2 FACS анализ культурных MLECs меченные антитела, специфичные для эндотелиальных-специфических маркеров. VE-кадгерина (CD144) или VEGFR2, как предъявлено обвинение, после чего фикоэритрин конъюгированными вторичными антителами, подтверждает эндотелиальных идентичность изолированных MLECs. Красная линия показывает изотипу определенный элемент управления, зеленая линия показывает анти-VE-кадгерина или анти-VEGFR2 - удельная-IgG.
Discussion
Микрососудистой этике доказали свою полезную модель во многих областях сосудистой биологии и, как считается, более физиологически, имеющие отношение к работе (например, ангиогенез), чем широко изучается HUVECs 3. Ранее сообщалось, что микрососудистых этике могут быть получены из почек, сердца, кожи, сетчатки глаза, мозга, глиомы, жировой ткани, а также 2 легких, 4-7, 10, 11. Тем не менее, последовательным и надежным методом для изоляции микрососудистых этике все еще требуется. Процедура, представленная здесь, модификацию ранее опубликованных протоколов 2, она отличается от большинства опубликованных процедур в том, что он использует щенков, а не взрослых животных. Это очень важно для изоляции успех как клетки от молодых животных, имеют более высокий потенциал и распространения культуры, связанных с их ткани, как правило, дают более высокие количества клеток. Неделю старых животных кажутся оптимальными, но молодых мышей (4 дня от роду) также может быть использован. Кроме того, больше или меньше количества щенков можно использовать, если требуется, так как мы добились успеха в изоляции MLECs от одного щенка. Однако, несмотря на повышение или понижение изоляции процессов, клеточной плотности покрытия должны остаться неизменными, так как это также имеет важное значение для клеточной пролиферации. 2-х ступенчатый очистке MLECs использованием магнитных шариков сопряженных первым анти-PECAM-1 и чем анти-ICAM-2 антител является гораздо более эффективным при получении чистых культур ЕС, чем ранее описанные пошагово процедуры очистки. Этот протокол избавляет от необходимости использовать очень кропотливой ручной техники, градиент центрифугирования и менее эффективных FACS сортировки для отбрасывания загрязняющих клетки, такие как фибробласты, клетки крови и клетки гладкой мускулатуры. В результате ТЗЭТ населения могут быть использованы для экстракорпорального анализ ангиогенных ответов, проницаемости сосудов и лейкоцитов переселения, заживление ран, а также биохимический анализ сигнальных путей. При необходимости может быть MLECs покрытием на различных поверхностях, таких как фибронектин или желатин покрытием покровные для иммунофлюоресценции или электрод массивы для транс-эндотелиальной сопротивления (TER) измерений. Полученные результаты могут быть непосредственно по сравнению с фенотипами наблюдается в естественных условиях, что особенно важно в контексте растущего числа нокаутом и трансгенных линий мышей. Успешная реализация данного метода для лабораторного анализа клеточных механизмов, лежащих дефектов наблюдается в естественных условиях, уже был представлен 12.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Медицинского колледжа Висконсина IACUC комитета по протоколу AUA # 00001206.
Acknowledgments
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Американской ассоциации сердца грант 0950118G.to MC-З.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Maruyama, Y. The human endothelial cell in tissue culture. Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).
- Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circ Res. 100, 158-173 (2007).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).
- Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).
- Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).
- Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues. J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).
- Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).
- Zachary, I., Gliki, G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).
- Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization. Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).
- Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice. Blood. 111, 2647-2656 (2008).
