Summary
Här beskriver vi ett protokoll för isolering och odling av murina pulmonell endotelceller. Denna metod består av mekaniker och enzymatiska lungvävnad dissociation samt en 2-stegs reningsprocess med hjälp av anti-PECAM-1 och anti-ICAM-2 antikroppar konjugerade till magnetiska kulor, vilket ger en ren endotelceller befolkning mestadels mikrovaskulära ursprung.
Abstract
Endotelceller en användbar forskning modell i många områden i vaskulär biologi. Sedan den första isolering 1, har mänskliga navelsträngen ven endotelceller (HUVECs) visat sig vara praktiskt, lätt att få och kultur, och därmed är det mest studerade endotelceller. Men för forskning fokuserad på processer som angiogenes, genomsläpplighet eller många andra, mikrovaskulära endotelceller (EC) är en mycket mer fysiologiskt relevant modell för att studera 2. Dessutom EC isolerad från knockoutmöss ge ett användbart verktyg för analys av proteiners funktion ex vivo. Flera metoder för att isolera och kultur mikrovaskulära EC av olika ursprung har hittills rapporterats 3-7, men konsekvent isolering och odling av ren EC är fortfarande ett stort tekniskt problem i många laboratorier. Här ger vi en steg för steg protokoll om en tillförlitlig och relativt enkel metod för att isolera och odla musen lung endotelceller (MLECs). I denna strategi, lungvävnad från 6 - till 8-dagar gamla ungar är först i bitar, kokas med kollagenas / dispase (C / D) lösning och spridda mekaniskt till encelliga suspension. MLECS är renade från cellsuspension använda positiv selektion med anti-PECAM-1-antikropp konjugerat till Dynabeads hjälp av en magnetisk Particle Concentrator (MPC). Sådana renade celler odlas på gelatin-belagd vävnadsodling (TC) rätter tills de blir sammanhängande. Vid det tillfället är celler renas ytterligare med Dynabeads kopplat till anti-ICAM-2 antikroppar. MLECs erhålls med detta protokoll uppvisar en kullersten fenotyp, som visualiseras genom faskontrast ljusmikroskopi, och deras endotel fenotyp har bekräftats med hjälp av FACS analys med anti-VE-cadherin 8 och anti-VEGFR2 9 antikroppar och immunofluorescens färgning av VE-cadherin. I våra händer, detta i två steg Isoleringsförfarande konsekvent och tillförlitligt ger en ren population av MLECs, vilket ytterligare kan odlas. Denna metod kommer att ge forskarna möjlighet att dra nytta av det växande antalet knockout och transgena möss att direkt korrelera in vivo-studier med resultat av in vitro-experiment som utförs på isolerade MLECs och därmed bidra till att avslöja molekylära mekanismer av vaskulära fenotyper observerats in vivo.
Protocol
1. Förbereda anti-PECAM-1-antikropp-konjugerad magnetiska kulor (Dynabeads)
- Bered 0,1% BSA i PBS genom att blanda 50 mg BSA i 50 ml PBS med hjälp av en virvel fram BSA löser sig. Sterilisera genom filtrering genom 0,22 ìm spruta filter. Förvaras vid 4 ° C.
- I TC huven, överföring 200 l väl återsuspenderad får anti-råtta IgG Dynabeads i en 1,5 ml Eppendorf-rör och tvätta pärlor: Montera röret på MPC och låt sitta i ca 1 minut så att kulorna i sediment. Sug ut supernatant, ta bort röret från MPC och återsuspendera pärlor i 1 ml steril 0,1% BSA / PBS. Pipettera upp och ner för att resuspendera kulorna.
- Upprepa tvätta tre gånger, för totalt fyra tvättar.
- Ta bort röret från MPC och återsuspendera pärlor i 500 l på 0,1% BSA / PBS.
- Tillsätt 10 l råtta anti-mus PECAM-1 (CD-31) antikropp till röret.
- Tumble över natten vid 4 ° C i det kalla rummet eller 2 timmar i rumstemperatur.
- Tvätta pärlor med steril 0,1% BSA / PBS som beskrivs i steg 1,2 fyra gånger.
- Ta bort röret från MPC och återsuspendera pärlor i 200 l 0,1% BSA / PBS. Förvara anti-PECAM-1-antikropp-konjugerat Dynabeads vid 4 ° C upp till 1 månad.
2. Isolera mus pulmonell endotelceller från neonatala möss
Innan du fortsätter med vävnaden rening protokollet är IACUC kommitté godkännande av det förfarande som krävs.
- Förbered följande:
- 15 ml av 1 mg / ml C / D-lösning i DMEM. Filter med 0,22 ìm sprutfilter och värm till 37 ° C.
- 50 ml koniska rör med 15 ml DMEM, lagra på is
- Isolering media (IM) som innehåller 20% FBS och 1x penicillin / streptomycin i DMEM
- 2% gelatin. Blanda 2 g av bovin hud gelatin med 100 ml dd vatten, autoklav 15 minuter och förvara vid 4 ° C. Värmas upp till 37 ° C till vätskeform innan beläggning TC kolvar.
- Bedöva tre 6-8 dagar gamla ungar med hjälp av ett IP-injektion av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg). Kontrollera om effektiviteten i anestesi och dissekera djur en efter en, enligt följande: Stift valpar gå ombord, blöta huden med 70% etanol och ta bort hud från bröstet med steril dissektion sax. Excise bröstkorgen att avslöja lungorna.
- Aseptiskt punktskatter enskilda lunga lober, försiktigt så att inte dissekera bronkerna och synliga bindväv runt lungorna. Kombinera alla lungor i iskallt DMEM. Euthanize valparna.
- Arbeta i TC huven, ta bort lungor lober från DMEM, plats i en 100 mm TC skålen och aspirera överskott DMEM.
- Använda steril sax, finhacka vävnaden fint genom att klippa ~ 100 gånger. Överför 15 ml varmt C / D-lösning för enzymatisk spjälkning. Inkubera 45 minuter vid 37 ° C på en rotator.
- I TC huva, aspirera rötade vävnaden suspensionen i en 20 ml spruta med 14 g kanyl bifogas och mal sönder klumpar i en enda cell fjädring, minst 12 gånger.
- Passera vävnaden fjädring genom en 70 ìm cell sil och tvätta filtret med 15 ml IM för att stoppa matsmältning.
- Pellets cellsuspension genom centrifugering vid 400x gi 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml 0,1% BSA / PBS.
- Överföring cellsuspension till 5 ml rundbottnad polystyren röret och tillsätt 22,5 l anti-PECAM-1 antikroppar konjugerade Dynabeads. Tumble i rumstemperatur i 12 minuter.
- Coat en T75 kolv med 2 ml 2% gelatin och aspirera överskott gelatin. Låt gelatinet torka inne i TC huven i ca 30 minuter före plätering celler.
- Efter pärla inkubationen är klar (steg 2,10), split cellsuspension lika i tre Eppendorf-rör och montera på MPC.
- När kulorna har sjunkit med MPC (~ 1 min), samla in supernatanten, ta bort röret från MPC, tvätta pärlor med ~ 1 ml 0,1% BSA / PBS, och sedan montera på MPC.
- Upprepa tvätta fyra gånger (totalt 5 tvättar)
- Återsuspendera pärlor i 1 ml VascuLife med EnGS-MV Life Faktorer Kit och 1x penicillin / streptomycin (VL) per rör, blanda väl.
- Tavla på en pre-belagd T75 kolven och att de totala volym i varje kolv till 10 ml med VL.
- Ändra media följande dag, låt en hel dag av tillväxt, och sedan ändra hälften av media varannan dag. När celler> 70-80% konfluenta eller mer (vanligen efter 3-4 dagar av kultur), kan de sorteras med anti-ICAM-2 Dynabeads.
3. Förbereda mot ICAM-2-antikropp-konjugerat Dynabeads
- Anti-ICAM-2 antikroppar konjugerade Dynabeads används för att ytterligare rena celler som har valts ut med anti-PECAM-1 antikroppar konjugerade Dynabeads och odlade fram konfluenta. Detta görs som beskrivs för anti-PECAM-1-antikropp-konjugerat Dynabeads (1, ovan), förutom att anti-mus-ICAM-2 antikroppar (CD-102) används istället för anti-PECAM-1-antikroppar.
- Anti-ICAM-2 antikroppar konjugerade Dynabeads kan lagras vid 4 ° C under upptill 1 månad.
4. Sortering Mus Lung endotelceller med anti-ICAM-2 Dynabeads
- Coat T75 vävnadskultur kolv med 2% gelatin.
- Aspirera media från konfluenta T75 kolven med celler och tvätta med 8 ml PBS.
- Aspirera PBS, tillsätt 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA och låta cellerna lossnar (ca 5 minuter). Knacka flaskor lätt att hjälpa loss.
- När celler har lossnat, tillsätt 2 ml IM att hämma trypsin och skrapa celler att lösgöra eventuella kvarvarande anhängare celler. Överföring cellsuspension till ett 15 ml rör och spinn ner i 5 min vid 400x g.
- Aspirera media och resuspendera cellpelleten i 2 ml 0,1% BSA / PBS.
- Överför till en 5 ml polystyren rundbottnad röret och tillsätt 10 l mot ICAM-2 Dynabeads. Tumble i 12 minuter vid RT.
- Dela cellsuspension i två 1,5 ml Eppendorf-rör och montera på MPC.
- Sug ut supernatant efter pärlor har följt en minut. Ta bort rör från MPC och återsuspendera varje rör i 1 ml 0,1% BSA / PBS. Remount på MPC.
- Upprepa tvätta fyra gånger (totalt 5 tvättar).
- Resuspendera varje rör med 1 ml VL och utföra ett celltal.
- Tavla celler vid 250-350K celler per T25 kolven och / eller 750K-1 miljon celler per T75 kolven.
- Ta volymen till 5 ml VL i T25 kolvar, och 10 ml i T75 kolvar.
- Ändra media varannan dag. Celler kan användas för experiment när kulturen når ca 80% confluency, vanligen i 2-3 dagar.
5. Representativa resultat
Vanligtvis, efter 6-7 dagar från den ursprungliga beredningen av celler, kan vi få ca 1,2 till 1,5 x 10 6 pulmonell endotelceller från tre 6-8 dagar gamla ungar. Celler visar typiska "kullersten" morfologi i ljusmikroskopi och visa VE-cadherin (CD144) färgning på cell-cell junctions, som är kännetecknande för endotelceller (Figur 1). Majoriteten av MLECs uttrycka VE-cadherin och VEGFR2 visat genom FACS analys (figur 2). Vanligtvis använder vi dem för experiment inom två veckor efter den första MLEC isolering.
Figur 1. Mikroskopisk analys av sammanhängande MLEC monolager. (A) ljusmikroskopi bild visar kullersten morfologi av odlade celler typiska för endotelceller. Enhetliga runda strukturer som ligger i perinukleära området många celler är de magnetiska kulor som används för MLEC isolering. (B) Endothelial-specifik VE-cadherin är lokaliserad vid cell-cell junctions som visas med hjälp av konfokalmikroskopi. Bar är representativ för 20 mikroM.
Figur 2 FACS analys av odlade MLECs märkta med antikroppar mot endotel-specifika markörer:. VE-cadherin (CD144) eller VEGFR2, som åtalat, följt av fykoerytrin-konjugerade sekundära antikroppar, bekräftar endothelial identitet isolerade MLECs. Röd linje visar isotyp specifika kontroll, visar grön linje mot VE-cadherin eller anti-VEGFR2 - specifika-IgG.
Discussion
Mikrovaskulära EC har visat sig vara en användbar modell i många områden i vaskulär biologi och tros vara mer fysiologiskt relevanta för studien (t.ex. angiogenes) än studerats ingående HUVECs 3. Tidigare har det rapporterats att mikrovaskulära EC kan erhållas från njure, hjärta, hud, näthinnan, hjärnan, gliom, fettvävnad och lunga 2, 4-7, 10, 11. Det är dock en konsekvent och tillförlitlig metod för isolering av mikrovaskulära EC fortfarande. Förfarandet som presenteras här är en modifiering av ett tidigare publicerade protokoll 2, det skiljer sig från de flesta publicerade förfaranden som den använder ungar istället för vuxna djur. Detta är avgörande för isolering framgång som celler från unga djur har en högre spridning potential och kulturer från sina vävnader tenderar att ge högre antal celler. En vecka gamla djur verkar vara optimalt, men yngre möss (4 dagsgamla) kan också användas. Dessutom kan högre eller lägre antal valpar användas om det krävs, som vi har lyckats isolera MLECs från en valp. Men medan trappa upp eller ner i isoleringen processen måste cellen plätering täthet förblir oförändrade, eftersom detta också är avgörande för celltillväxt. Den 2-stegs reningsprocess för MLECs med magnetiska kulor konjugerat första som anti-PECAM-1 och än mot ICAM-2-antikroppar är mycket mer effektiva på att få rena EG kulturer än den tidigare beskrivna ett steg rening förfaranden. Detta protokoll eliminerar behovet av att använda mycket mödosamma manuella tekniker, gradient centrifugering och mindre effektiva FACS sortering för kassering förorena celler såsom fibroblaster, blodkroppar och smidig muskelceller. Den resulterande MLEC befolkningen kan användas för in vitro-analys av angiogena svar, vaskulär permeabilitet och leukocyt transmigration, sårläkning samt biokemisk analys av signalsystem. Vid behov kan MLECs beläggas på olika ytor som fibronektin eller gelatin-belagd täckglas för immunofluorescens eller elektrod arrayer för trans-endotelceller motstånd (TER) mätningar. Uppnådda resultaten direkt kan jämföras med fenotyper observerats in vivo, vilket är särskilt viktigt mot bakgrund av det växande antalet knockout och transgena linjer mus. Framgångsrikt genomförande av denna metod för in vitro-analys av cellulära mekanismer underliggande defekter observerats in vivo, har redan lagts fram 12.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Medical College of Wisconsin IACUC kommittén enligt protokollet AUA # 00.001.206.
Acknowledgments
Denna forskning stöds delvis av American Heart Association bevilja 0950118G.to MC-W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| 14G cannula | Fisher Scientific | 1482516N | |
| 20 ml syringe | BD Biosciences | 309661 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | |
| Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | |
| anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Biosciences | 553369 | |
| anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Biosciences | 553326 | |
| Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Group | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | |
| Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Cell strainer 70 μm nylon | Falcon BD | 352350 | |
| tissue culture flask 75 cm2 | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Maruyama, Y. The human endothelial cell in tissue culture. Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).
- Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems. Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circ Res. 100, 158-173 (2007).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).
- Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).
- Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).
- Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues. J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).
- Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).
- Zachary, I., Gliki, G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).
- Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization. Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).
- Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice. Blood. 111, 2647-2656 (2008).
