Summary
Imprinting संयंत्र और स्तनपायी प्रजनन में एक घटना है. डीएनए मेथिलिकरण imprinting के तंत्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. एण्डोस्पर्म अलग और में अंकित जीन की मेथिलिकरण स्थिति का निर्धारण
Abstract
Arabidopsis thaliana epigenetic तंत्र के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है. कारणों में से एक है हानि के समारोह डीएनए methyltransferases के अशक्त उत्परिवर्ती व्यवहार्य है, इस तरह एक प्रणाली के लिए अध्ययन कैसे एक जीनोम में डीएनए मेथिलिकरण की हानि वृद्धि और विकास को प्रभावित करता है प्रदान. Imprinting मातृ और पैतृक alleles के अंतर अभिव्यक्ति के लिए संदर्भित करता है और दोनों स्तनपायी और पौधों में प्रजनन के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. डीएनए मेथिलिकरण निर्धारित करता है कि एक अंकित जीन की मातृ या पैतृक alleles व्यक्त की है या खामोश करने के लिए महत्वपूर्ण है. फूल पौधों में, वहाँ प्रजनन में एक डबल निषेचन घटना है: एक शुक्राणु सेल अंडा सेल केंद्रीय कक्ष के साथ एण्डोस्पर्म को जन्म दे भ्रूण और एक दूसरे शुक्राणु फ़्यूज़ के फार्म fertilizes. Endosperm ऊतक जहां imprinting पौधों में होता है Medea, एक सेट डोमेन Polycomb समूह जीन, और FWA, एक प्रतिलेखन विनियमन कारक फूल, पहले दो एण्डोस्पर्म और उनकी अभिव्यक्ति में अंकित होना दिखाया जीन में डीएनए मेथिलिकरण और demethylation द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं पौधों. आदेश में एक जीन और एण्डोस्पर्म में मेथिलिकरण पैटर्न की imprinting स्थिति निर्धारित करने के लिए, हम एण्डोस्पर्म पहले अलग करने में सक्षम होने की जरूरत है. चूंकि बीज Arabidopsis में छोटे है, यह Arabidopsis एण्डोस्पर्म अलग चुनौती बनी हुई है और इसकी मेथिलिकरण की जांच . इस वीडियो प्रोटोकॉल में, हम रिपोर्ट है कि एक आनुवंशिक पार कैसे आचरण करने के लिए, बीज से एण्डोस्पर्म ऊतक अलग करने के लिए, और bisulfite अनुक्रमण द्वारा मेथिलिकरण स्थिति का निर्धारण.
Protocol
I. जेनेटिक पार
1. महिला माता पिता Emasculating
आदेश में डीएनए अनुक्रम बहुरूपता, दो अलग अलग ecotypes, कोलंबिया (कर्नल 0) 0 और ler जैसे, महिला और पुरुष माता पिता के रूप में चुना जाएगा का उपयोग करके मातृ और पैतृक alleles भेद करने के लिए. पौधों युवा और स्वस्थ होना चाहिए. एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक महिला माता पिता प्रभावहीन कर सकते हैं, टोपी का छज्जा, या नग्न आंखों शीशा. चरण 12 फूल का पता लगाएँ (Smyth एट अल, 1990) और कैंची के साथ डंठल के आधार कतरन द्वारा किसी भी फूल या ऊपर siliques और उन्हें नीचे हटायें . धीरे टिप के आधार पर 95% इथेनॉल एक बीकर, जो संदंश पर किसी भी पराग अनाज निकालने और पराग के रूप में अच्छी तरह से मार देगा में सूई से संदंश जीवाणुरहित. धीरे अलावा फूल कलियों का उपयोग संदंश जिज्ञासा, और धीरे से 4 sepals, 4 पंखुड़ियों, और 6 पुंकेसर निकालने के लिए, पुष्प - योनि नंगे और अक्षुण्ण छोड़ने. Carpels करने के लिए इस प्रक्रिया के दौरान नुकसान से बचने की कोशिश करें.
2. पराग दाता उठा और बाहर परागण ले जाने
सबसे अच्छा पराग दाताओं एक 90 ° पुष्प - योनि (Smyth एट अल, 1990), जिसमें पराग का एक बहुत कुछ बहा है कोण पर विस्तार पंखुड़ी के साथ 14 चरण में खुला फूल anthesed हैं. आधार पर फूल ले लो और डंडी बस के ऊपर, जो फूल खुले प्रसार के लिए कारण होगा. Anther के साथ तैयार पुष्प - योनि के कलंक धूल. परागण के बाद, पीले पराग, जो आसानी से एक खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है है कलंक के साथ कवर किया जाएगा.
3. पार लेबल
एक संयंत्र पर सभी नपुंसक बना दी जाती pistils परागण के बाद, हम एक गहने टैग और महिला और पुरुष माता पिता और तारीख की जानकारी के साथ लेबल पार. करीब मिट्टी में संयंत्र के लिए एक दांव प्लेस, एक स्ट्रिंग का उपयोग हिस्सेदारी पुष्पक्रम के स्टेम टाई, और एक प्लास्टिक की थैली के साथ परागण pistils कवर.
द्वितीय. Arabidopsis में endosperm ऊतकों के अलगाव
1. तैयारी सामग्री
हम आम तौर पर आवश्यक एण्डोस्पर्म और भ्रूण के ऊतकों कटाई से पहले तैयार सामग्री मिल: एक तरल नाइट्रोजन टैंक, तरल नाइट्रोजन, एक विदारक माइक्रोस्कोप, ठीक टिप (5 आईनॉक्स Dumont जीव विज्ञान द्वारा FST, स्विट्जरलैंड.) संदंश, खुर्दबीन गिलास स्लाइड के दो नए जोड़े ( 3 1.0 मिमी "एक्स 1" एक्स), 0.3 एम के पीएच 5.7 समाधान sorbitol और 5 मिमी एमईएस.
2. संग्रह siliques
7 से कम - या 8 दिन परागण - के बाद (डीएपी), बीज embryogenesis की देर टारपीडो मंच के मध्य में काटा जा एण्डोस्पर्म और भ्रूण के लिए dissected के लिए तैयार हैं. कभी कभी, यह 9-10 डीएपी ले अगर नपुंसक बना दी जाती फूल भी जवान हो सकता है.
3. अलग एण्डोस्पर्म और भ्रूण
चूंकि Arabidopsis बीज छोटे हैं, हम एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग एण्डोस्पर्म और भ्रूण अलग . एक खुर्दबीन के नीचे एक 8-डीएपी Silique रखो, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए Silique डंडी पकड़ और संदंश की एक और जोड़ी के टिप का उपयोग करने के लिए जहां दो carpels फ्यूज मार्जिन में खुला Silique स्लाइड. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें पीएच 0.3 sorbitol एम और 5 मिमी एमईएस के 5.7 समाधान पर एक बीज लेने के लिए, micropyle अंत में एक छोटे से कट बनाने के लिए बाहर भ्रूण स्लाइड, बिना खतना के अंत निचोड़ करने के लिए बाहर धक्का एण्डोस्पर्म और बीज कोट से अलग एण्डोस्पर्म (Kinoshita एट अल., 2004). तरल नाइट्रोजन में अलग microtubes में भ्रूण और endosperm रखो. इस जारी रखें जब तक हम 10-15 siliques से भ्रूण या एण्डोस्पर्म संचित और फिर एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूब की दुकान. कुछ मामलों में, एण्डोस्पर्म बीज कोट, अर्थात् से अलग होना नहीं है, एक और जीन imprinting विश्लेषण के लिए बीज कोट मिश्रण endosperm से कुल शाही सेना को अलग कर सकते हैं.
III. Bisulfite अनुक्रमण
1. अभिकर्मकों की आवश्यकता
जीनोमिक डीएनए, प्रतिबंध एंजाइमों, 3 एम NaOH (हौसले) बनाया, 6.42 एम / यूरिया 4 एम सोडियम bisulfite (2 एम सोडियम metabisulfite, सिग्मा Aldrich, S9000, Na2S2O5, आण्विक वजन: 190) की तैयारी के लिए Cetyltrimethyl अमोनियम ब्रोमाइड (CTAB) 10 मिमी hydroquinone, एक डीएनए शुद्धि किट (Promega विज़ार्ड डीएनए सिस्टम क्लीन - अप, बिल्ली A7280 #.), ते बफर, 6.3 एम NaOH (नया बनाया), 10 एम राष्ट्रीय राजमार्ग OAC 4, 20 μg / μL tRNA, और 100% इथेनॉल .
2. Bisulfite उपचार प्रोटोकॉल का विवरण
- जीनोमिक एण्डोस्पर्म या भ्रूण डीएनए (रोजर्स और Bendich, 1988) एक CTAB कार्यविधि का उपयोग पृथक.
- 20 μL 100 प्रतिबंध एंजाइमों कि विश्लेषण किया क्षेत्र के बाहर कटौती के साथ μL कुल मात्रा में 2 जीनोमिक डीएनए के μg - डाइजेस्ट 100 एनजी. विदेश मंत्रालय के प्रमोटर के लिए, हम XhoI, NdeI, और PstI या HindIII का उपयोग करें.
- पांच मिनट के लिए उबलते डीएनए द्वारा प्रतिबंध एंजाइमों denature और फिर बर्फ पर बुझाना.
- 15 मिनट के लिए एम 3 NaOH और सेते 1 / 9 (20 μL पचा डीएनए के लिए 2.2 μL) 37 ° मात्रा सी जोड़ें.
- एक 250 μL पीसीआर ट्यूब के समाधान स्थानांतरण.
- बाँझ आसुत जल के 10 एमएल में यूरिया की 7.5 ग्राम भंग, धीरे धीरे 1-2 घंटे से अधिक के 7.6 ग्राम सोडियम metabisulfite जोड़ने और हीटिंग आमतौर पर भंग में मदद करता है, 5 के लिए नया बनाया 10 एम NaOH के साथ पीएच समायोजित, एक अंतिम बाँझ आसुत जल जोड़ें 20 एमएल मात्रा. यह 6.24 एम यूरिया / 4 एम सोडियम bisulfite समाधान है.
- 6.24 एम / 4 एम सोडियम bisulfite 5.36 एम के अंतिम एकाग्रता समाधान यूरिया और 3.44 एम, क्रमशः (Paulin एट अल., 1998) जोड़ें. उदाहरण के लिए, 6.42 एम यूरिया / 4 एम सोडियम bisulfite विकृत जीनोमिक डीएनए (जिओ एट अल., 2003) के ऊपर 22.2 μL समाधान के 208 μL जोड़ें.
- 0.5 मिमी (20 μL पाचन के लिए 12 μL) के अंतिम एकाग्रता में डीएनए से 10 मिमी hydroquinone जोड़ें.
- 55 ° 15 मिनट और 95 डिग्री सेल्सियस लिए 30 सेकंड के लिए सी के 30 चक्रों: एक पीसीआर मशीन में bisulfite उपचार संचालित
- Bisulfite इलाज डीएनए Promega से जादूगर डीएनए क्लीन अप सिस्टम का उपयोग कर फीका बनाना और प्रोटोकॉल का पालन (Jacobsen एट अल, 2000 ).
- ते की सटीक मात्रा desalting बाद स्तंभ से बरामद उपाय और 37 पर 0.3 एम. सेते के अंतिम एकाग्रता के लिए 6.3 एम NaOH जोड़ने ° C 15 मिनट के लिए.
- 10 एम एम 3 के एक अंतिम एकाग्रता, 20 μg / μL tRNA के 2 μL, और 100% इथेनॉल के 3 खंडों में राष्ट्रीय राजमार्ग OAC 4 (7.0 पीएच) जोड़ें और फिर मिश्रण. 14,000 rpm पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- गोली 70% इथेनॉल के साथ एक बार, धो एक छोटी अपकेंद्रित्र करते हैं, और अतिरिक्त इथेनॉल हटायें.
- 5-10 मिनट और 25 में resuspend के लिए एक speedvac में सूखी गोली - 100 μL ते बफर डीएनए की मात्रा शुरू करने पर निर्भर करता है. अब सोडियम bisulfite इलाज डीएनए पीसीआर विश्लेषण के लिए तैयार है.
3. पीसीआर प्रवर्धन
- चूंकि unmethylated cytosines uracil में कनवर्ट कर रहे हैं, यह मुश्किल है एक बड़े टुकड़ा एक टेम्पलेट के रूप में डीएनए bisulfite इलाज का उपयोग बढ़ाना. इस प्रकार, हम आम तौर पर प्राइमरों डिजाइन करने के लिए एक उत्पाद अब 500 बीपी से बढ़ाना. 4-केबी विदेश मंत्रालय के प्रमोटर अनुक्रम करने के लिए, हम प्राइमरों के कई सेट डिजाइन और पूरे क्षेत्र को कवर करने के लिए 14 अतिव्यापी टुकड़े प्रवर्धित (जिओ एट अल., 2003).
- अनुक्रम करने के लिए शीर्ष भूग्रस्त, आगे एक प्राइमर, मैं) डिजाइन करने में जी () अमीर क्षेत्र guanine चुनने के क्रम में प्राइमरों में अतिरिक्त लंबे nucleotides के बिना एक उच्च तापमान annealing, द्वितीय) परिवर्तन (साइटोसिन) सी, वाई ( तटरक्षक और सीएनजी संदर्भों में) pyrimidine और शेष (थिमाइन) टी सी बदल जाते हैं. एक रिवर्स प्राइमर, मैं) के डिजाइन में एक सी युक्त क्षेत्र का चयन; II) जी आर (प्यूरीन) के तटरक्षक और सीएनजी संदर्भों में परिवर्तन और एक (adenine) शेष जी को बदलने.
- अनुक्रम करने के लिए नीचे भूग्रस्त, आगे एक प्राइमर, मैं) डिजाइन करने में एक सी समृद्ध क्षेत्र का चयन, द्वितीय) आर जी और तटरक्षक और सीएनजी संदर्भों में बदलने के ए के लिए एक रिवर्स प्राइमर, मैं) डिजाइन चुन में शेष जी को बदलने जी समृद्ध क्षेत्र, द्वितीय) सी वाई (pyrimidine) के तटरक्षक और सीएनजी संदर्भों में परिवर्तन और टी. करने के लिए शेष सी बदल
- हम आमतौर पर प्रत्येक पीसीआर प्रवर्धन (जिओ एट अल., 2003) के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सोडियम डीएनए bisulfite इलाज के 1-2 μL का उपयोग करें. पीसीआर उत्पाद के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया जा टुकड़ा के सही आकार की पुष्टि, जेल तो होना शुद्ध करने के लिए और एक डालने के रूप में Topo टीए क्लोनिंग वेक्टर pCR2.1 (Invitrogen) में क्लोन की जरूरत है. एक एकल कॉलोनी उठाया है और सुसंस्कृत, प्लास्मिड डीएनए निकाला और अनुक्रमण के लिए भेजा.
4. अनुक्रम विश्लेषण
bisulfite अनुक्रमण के सिद्धांत है कि unmethylated साइटोसिन pH5.0 में सोडियम bisulfite के उच्च एकाग्रता जो पीसीआर उत्पाद में थिमाइन के रूप में परिलक्षित हो जाएगा द्वारा hydrolytic deamination के कारण uracil में कनवर्ट हो जाएगा, जबकि 5 - मिथाइल साइटोसिन सोडियम bisulfite द्वारा संशोधित नहीं किया जाएगा और पीसीआर प्रवर्धन (. Frommer एट अल, 1992. क्लार्क एट अल, 1994) के बाद साइटोसिन हो रहते हैं . अनुक्रमण परिणाम प्राप्त करने के बाद, हम इसे कतरा विशिष्ट टेम्पलेट है कि पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ तुलना. यदि टेम्पलेट में एक साइटोसिन अवशेषों अनुक्रमण परिणाम में एक थिमाइन के रूप में पढ़ता है, यह इंगित करता है कि साइटोसिन methylated नहीं है. यदि टेम्पलेट में एक साइटोसिन अवशेषों अनुक्रमण में एक साइटोसिन रहता है, यह मतलब है कि साइटोसिन methylated है.
चतुर्थ. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1.
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Discussion
यह अपेक्षाकृत आसान एण्डोस्पर्म और बीज कोट से भ्रूण अलग है, लेकिन यह बीज कोट से अलग एण्डोस्पर्म, embryogenesis के प्रारंभिक या मध्य टारपीडो स्तर पर बीज के लिए विशेष रूप से कठिन है. चूंकि बीज कोट केवल ऊतक का एक बहुत छोटा कुछ जीनों के लिए राशि का योगदान है, जैसे विदेश मंत्रालय, और FWA, हम के बीज कोट से एण्डोस्पर्म अलग नहीं है. इसका मतलब है कि हम एण्डोस्पर्म और बीज कोट ऊतकों की एक मिश्रण से RNAs अलग कर सकते हैं, एक जीन की मातृ और पैतृक alleles की अभिव्यक्ति की जाँच करें, भ्रूण में अभिव्यक्ति के साथ तुलना, और जीन की imprinting स्थिति निर्धारित करें.
Bisulfite अनुक्रमण के लिए, लिए डिज़ाइन प्राइमरों कतरा विशिष्ट होना चाहिए. कभी कभी, यह bisulfite इलाज जीनोमिक सोडियम bisulfite उपचार द्वारा क्षतिग्रस्त डीएनए टेम्पलेट के कारण डीएनए से एक टुकड़ा बढ़ाना मुश्किल है, और हम आम तौर पर विभिन्न क्षेत्रों और छोटे टुकड़ों में पीसीआर प्राइमरों के विभिन्न सेट की कोशिश है. प्रतिबंध एंजाइम पाचन के बाद, जीनोमिक डीएनए एकल असहाय में पूरी तरह से विकृत हो bisulfite deamination के बाद से लगभग डबल असहाय डीएनए संरचना में साइटोसिन अवशेषों पर काम नहीं करता है है की जरूरत है. एक अन्य महत्वपूर्ण यह है कि bisulfite उपचार के पूरा होने की जरूरत है. यदि एक ज्ञात unmethylated साइटोसिन bisulfite अनुक्रमण में थिमाइन कनवर्ट नहीं है, यह इंगित करता है कि bisulfite इलाज ठीक से नहीं आयोजित किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, अगर एक अज्ञात क्षेत्र में कई साइटोसिन अवशेषों bisulfite अनुक्रमण में थिमाइन नहीं बदल रहे हैं, यह क्षेत्र में सभी methylated साइटोसिन अवशेषों के संकेत से सबसे बेबदल डीएनए का प्रवर्धन के कारण की संभावना नहीं बल्कि है.
सोडियम bisulfite अनुक्रमण ठीक पता चलता है अगर प्रयोग सही ढंग से आयोजित किया जाता है हो सकता है कि क्या एक विशेष साइटोसिन अवशेषों methylated या एक जीनोम में नहीं (हेंडरसन एट अल. , 2010). Hsieh एट अल, सोडियम bisulfite का मेल ही में Illumina जीनोम विश्लेषक अनुक्रमण उच्च throughput मंच जैसे उच्च throughput अनुक्रमण तकनीक, साथ अनुक्रमण, एक संयंत्र और स्तनधारियों में एकल आधार संकल्प (Cokus एट अल, 2008 में epigenome नक्शा कर सकते हैं , 2009, लिस्टर एट अल, 2008, लिस्टर एट अल, 2009)..
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों सुश्री जेनिफर एम. Lommel और तारा एन Rognan Arabidopsis पौधों के रखरखाव के लिए धन्यवाद . यह काम शुरू हुआ - सेंट लुई विश्वविद्यालय और संस्थान राष्ट्रीय स्वास्थ्य 1R15GM086846-01 और डब्ल्यू जिओ 3R15GM086846-01S1 अनुदान के से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
Supplies
Reagents
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References
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