1. Voorbereiden van Ice-koude Zuurstofrijk Artificial cerebrospinale vloeistof (ACSF) Bereid 2 L van "Ca 2 +-vrij" ACSF. In een 2L erlenmeyer, voeg ongeveer 1,5 L van steriele of dubbel gedestilleerd H 2 O, en beginnen onder krachtig roeren op een roer plaat. Voeg de volgende ACSF componenten (in mm): 124 NaCl, 2 KCl, 1,25 KH 2 PO 4, 2 MgSO 4, 26 NaHCO 3 en 10 dextrose (zie tabel 1). Brengen tot een volume van 2 L met gedestilleerd H 2 O. Met behulp van een aquarium bubbler en slangen aangesloten op een 95% O 2 / 5% CO 2 de lucht tank, zuurstof ACSF krachtig gedurende ongeveer 20-30 minuten. Controleer de pH en, indien nodig, aan te passen aan 7,4 met NaOH of HCl. Giet 750 ml van zuurstofrijk Ca 2 +-vrij ACSF in een aparte erlenmeyer, dek de opening af met parafilm, en transfer naar een ultrafreezer (-80 ° C) gedurende 20-30 minuten. Deze media zal gebruikt worden voor dissectie van de hersenen en acute hippocampus plakken *. Voeg 2 mM CaCl 2 om de resterende 1,25 L volume van ACSF #, goed roeren, en oxygenatie met 95% O 2 / 5% CO 2 te hervatten. Deze media zal worden gebruikt voor het opslaan van de hersenen plakjes na dissecties, en voor perfuseren plakken tijdens de elektrofysiologische opnamen. * Ice-koude Ca 2 + vrije media wordt gebruikt om de stofwisseling vertragen en Ca 2 +-afhankelijke excitotoxiciteit te minimaliseren tijdens de dissectie. # Veranderingen in de Ca 2 + ontregeling bij het ouder worden en AD kan een grote impact hebben op de inductie van Ca 2 +-afhankelijke synaptische plasticiteit 4-9. Tegenstrijdige rapporten over leeftijdsverschillen in LTD kunnen deels toe te schrijven aan het gebruik van verschillende ACSF Ca 2 +: Mg2 + ratio's tijdens de slice-opnamen (zie 2,4,10). Het belang van Ca 2 + regeling en de ACSF Ca 2 +-niveau in veroudering studies wordt behandeld in meer detail in de discussie sectie. Terwijl de Ca 2 +-vrij ACSF is bevriezen, bereiden een holding kamer voor het onderhoud van de hersenen plakjes voor en tijdens elektrofysiologisch opnames *. We maken gebruik van een aangepaste macro-holding kamer die vier individuele microchambers (zie figuur 2) bevat. De macrochamber is gevuld met een steriele, zuurstofrijke H 2 O en de microchambers zijn in wezen eilanden die uitsteken boven het wateroppervlak. Binnen elke microchamber, plakken rust op gesaldeerd invoegen in een ondiepe poel van zuurstofrijk ACSF. Slices zijn niet volledig onder water, maar zitten op een interface met de bevochtigde lucht. Een geïsoleerde verwarmingselement in de macrochamber zorgt voor temperatuurregeling. * Verschillende soorten van het bedrijf kamers zijn ook commercieel verkrijgbaar (bijv. Warner Instruments biedt een onderdompeling-stijl "Pre Kamer # BSC-PC) en moet geschikt zijn voor gebruik in de veroudering en transgene muizen slice studies. In een snuifje, kan schijfjes worden gehandhaafd voor enkele uren in een kleine petrischaal gevuld met ACSF. Maak een klein gaatje in het deksel van een petrischaal zuurstof levering buis. Zorg ervoor dat zuurstof belletjes niet fysiek de plakjes schudden. Slices voldoende zuurstof krijgen als de buis is verhoogd tot net boven het ACSF oppervlak (gas dispersie moet leiden tot een inkeping in de vloeistof oppervlak). 2. Brain verwijderen en de hippocampus Dissection in Aged (> 20-maanden-oude-ratten) Bereid de dissectie gebied * naast een grote wastafel (zie figuur 1 en tabel 2). Plaats een klein dier guillotine in de gootsteen en de lay-out chirurgische instrumenten en materialen voor de hersenen verwijderen en de hippocampus dissectie met een opgevouwen papieren handdoek, een # 11 scalpel, beebee schaar, bot rongeurs, een "Hippocampus gereedschap" (een gespecialiseerd dual spatel uit fijne chirurgische instrumenten), kleine chirurgische schaar, een dunne double-ended spatel, plastic Pasteur pipet, 110 mm diameter Whatman filter papier, een deksel 100 mm glazen petrischaal gevuld met ijs, en een plastic lepel. Houd ook een plastic zak in de buurt voor de verwijdering van het karkas. * Brain-extractie moet worden ingevuld zo snel mogelijk, dus het is een goed idee om mentaal "wandeling door" de procedure en leg uw instrumenten die in de volgorde van de te gebruiken. Verwijder de Ca 2 +-vrij ACSF uit de vriezer. Media moeten gedeeltelijk, niet helemaal, bevroren. Giet ongeveer 50 mL van ACSF in een glazen beker, dek af met Parafilm, en leg naast de dissectie gebied. Deze media zal worden gebruikt om kort op te slaan in de hersenen als het eenmaal is verwijderd. De overige Ca 2 +-vrije media zal gebruikt worden om het reservoir te vullen in het Vibratome voor slice voorbereiding. Deze media kunnen worden reoxygenated, of gewoon bedekt met parafilm en geplaatst in de koelkast bij 4 ° C. Euthanaseren de rat met behulp van methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Onze dieren worden geplaatst in een kleine plexiglas kamer die geleidelijk wordt gevuld met 100% CO 2. Verlies van het bewustzijn treedt in het algemeen binnen vijf minuten en wordt bevestigd door de afwezigheid van reflex-activiteitna een teen knijpen. Onthoofden de rat onmiddellijk rostraal van de eerste halswervel en plaats het hoofd op de gevouwen papieren handdoek. Met behulp van de # 11 scalpel, al snel maakt een incisie in het midden van de hoofdhuid te beginnen bij het neusbeen en uitvoeren caudaal naar het schedelbeen. Zorg ervoor dat u volledig dwars door de huid spier volledig blootleggen van de hechtingen op het dorsale oppervlak van de schedel. Knip de schedel platen met beebee schaar. Bij jonge ratten en muizen, kan de schedel snel worden verwijderd met het gebruik van bot rongeurs alleen. Echter, in de leeftijd ratten hebben dikkere schedels dan jonge volwassen ratten en muizen die kunnen maken deze procedure moeilijk. We hebben geconstateerd dat dwars door de schedel sterk botverwijdering faciliteert met rongeurs, vermindert schade aan de hersenen, en bespaart kostbare seconden. Met het hoofd van de rat stevig op het aanrecht, plaats het snijvlak van de onderste pure van de beebee schaar in de superieure gebied van het foramen magnum op het achterste gedeelte van de schedel. Houd de onderste pure stevig tegen binnenste van de schedel van het oppervlak (en weg van de hersenen) *, dwars door de occipitale plaat, en dan langs de middellijn hechting van de pariëtale platen. Ga rostraal tot u dwars door de frontale schedel platen. * Het is van cruciaal belang dat de druk is weg uit de hersenen gericht zijn op onbedoelde meten te voorkomen. Scheiden de occipitale, pariëtale en temporale schedel platen van de hersenen. Houd het hoofd stevig op het aanrecht voor stabiliteit en de hefboomwerking en schuif de onderkaak van de rongeurs onder de linker pariëtale plaat handhaven van de druk tegen de binnenkant van de schedel. Vervolgens Knijp de kaken van de rongeurs en rol je pols naar boven en naar u toe om de pariëtale en occipitale platen weg te trekken van de hersenen. Dit moet blootstellen grootste deel van het dorsale oppervlak van de linker hersenhelft. Indien nodig, gebruik dan de rongeurs aan de linker frontale plaat te verwijderen ook. Herhaal dit proces voor de andere halfrond. Zodra de platen zijn ontheemd, snel te inspecteren voor elke dura zaak die kan worden bevestigd aan de tijdelijke platen en strekte zich over het oppervlak van de hersenen. Voorzichtig trek deze met de rongeurs of wegknippen met een schaar *. Nu, schuift u de bovenkaak van de rongeurs tussen de hersenen en de juiste tijdelijke plaat, opnieuw houden van de druk in de richting van de schedel en de weg van de hersenen. Knijp en draai de tijdelijke plaat uit de buurt van de hersenen. U moet horen / voelen een 'crunch' als je dit doet. Herhaal dit voor de linkerkant. * De dura kan moeilijk zijn te herkennen, vooral als het dier is transcardially is geperfuseerd met ACSF. Echter, als dura niet worden verwijderd, zullen ze slice door de hersenen (en waarschijnlijk de hippocampus), als een scheermes als tijdelijke borden worden verwijderd. Knippen van de dura weg in de buurt van de tijdelijke borden zal het minimaliseren van de kans op steken in de hersenen. Pak het brein *. Snel te verwijderen van de parafilm van de Ca 2 +-free ACSF "modderige". Schuif nu de brede spatel hoofd van de hippocampus gereedschap tussen de ventrale oppervlak van de hersenen en de schedel onderste platen totdat deze volledig onder de hersenen. Beweeg de spatel zijdelings van links naar rechts en vervolgens naar voren en naar achteren een paar keer om intact craniale zenuwen te verbreken. Nu schep de hersenen uit met de hippocampus tool en onder te dompelen in Ca 2 +-vrij ACSF en bedek met parafilm. Laat de hersenen chill gedurende ongeveer een minuut. Dit is een geschikt moment schoon te maken uit de guillotine, gooi het karkas, en reorganiseren van de dissectie gebied. * Voor de stappen 2.3-2.7, de snelheid is van de essentie. We proberen deze procedure (van onthoofding naar de hersenen onderdompeling in ACSF) compleet in 30-35 sec. In onze ervaring, extracties die langer dan een minuut lijkt een negatief effect hippocampus plak de gezondheid, vooral voor de oude ratten. Met behulp van deze procedures, hebben we geen verschillen waargenomen in de extractie-tijden tussen de oude en jonge ratten voor onze studies. Extract van de hippocampus. Plaats het Whatman filtreerpapier op het deksel van het ijs-koude petrischaal en dempen het papier met ACSF het gebruik van de plastic overdracht pipet. Haal de hersenen van de ACSF met behulp van een lepel en plaats op de bevochtigde Whatman papier. Met behulp van de scalpel, verwijder de kleine hersenen en ongeveer een kwart van de rostrale frontale kwabben. Voer de scalpel door de intrahemispheric spleet volledig te scheiden van de twee hersenhelften. Plaats een halfrond terug in het ACSF modderige en "stand" de andere op het ontleden podium zodanig dat het frontale vlak van de frontale kwab is naar beneden gericht. Je moet duidelijk kunnen de hersenstam en midden hersenen (die zijn wit) van de bovenliggende cortex (die roze / grijs) te onderscheiden. Zoek de superieure en inferieure colliculi op de middenhersenen, deze eruit zal zien twee witte "knoppen" en zal aan de "top" van de hersenen in deze oriëntatie. Met behulp van de chirurgische schaar voorzichtig houd de middenhersenen op zijn plaats en schuif de wegen spatel in het gat wordentussen de colliculi en de neocortex. Heel voorzichtig verder met de spatel glijden en trek de hersenstam / middenhersenen / thalamus weg waaruit de binnenkant van de laterale ventrikel en de mediale oppervlak van de hippocampus. Gebruik de scherpe rand van de spatel om soepel verbreken van de fornix, een witte vezelbundel zich op de voorste / dorsale deel van de hippocampus. Met de schaar voorzichtig blijven de hersenstam / middenhersenen / thalamus weg te trekken zonder dat het volledig verbreken van de rest van de hersenen. De cortex met hippocampus zou nu vrij terug te leggen van de hersenstam *. Draai vervolgens het ontleden stadium, zodat u op zoek bent naar de mediale hippocampus en cortex liggende alsof het een sagittale doorsnede (minus de thalamus). U ziet nu de witte fimbria vezels die een ondiepe hyperbool aan de onderkant van de hippocampus in dit vlak vorm. Met behulp van de plastic overdracht pipet voorzichtig spuiten sommige ACSF in de opening onder de fimbria te scheiden van de hippocampus van de cortex te helpen. Voorzichtig de spatel glijden in dit gat, zodanig dat de lange kant van de spatel loopt parallel met de lange as van de hippocampus. Zodra de spatel is volledig onder de hippocampus, houdt u de hersenstam / middenhersenen / thalamus stevig met de schaar en het wegrollen van de spatel uit je lichaam naar de hippocampus fysiek gescheiden van de rest van de hersenen. Zodra de hippocampus is vrij voorzichtig trimmen weg alle resterende cortex, bloedvaten en witte stof. Schep een kleine hoeveelheid ACSF modderige naar de andere kant van het ontleden podium. Voorzichtig de positie van de hippocampus naast de slush en blussen met enkele milliliters van ACSF het gebruik van de plastic overdracht pipet. Verwijder vervolgens de andere halfrond en herhaal de dissectie. * Mogelijk hebt u de schaar om snip weg extra bindweefsel, witte stof, of vaatstelsel, dat scheiding van de cortex voorkomt de hersenstam. De punten van uw schaar zal zeer dicht bij de hippocampus, dus zorg ervoor dat heel precies snips (scherpe schaar is een must) te leveren. 3. Brain verwijderen en de hippocampus Dissection in Aged transgene muizen Euthanaseren en onthoofden de muis en maak een middellijn incisie op de hoofdhuid, zoals beschreven in paragraaf 2.3. Muizen hebben veel dunner schedels dan ratten die sterk vereenvoudigt de hersenen extractie. Dwars door de schedel met een schaar is dus niet nodig. Gebruik bot rongeurs met kleinere kaken (tabel 2) weg te trekken occipitale, pariëtale en temporale schedel platen. Net als bij de rat, vergeet niet om gecontroleerde bewegingen te gebruiken en goed de onderkaak van de rongeurs te trekken in de interne oppervlak van de schedel en uit de buurt van de hersenen als het verwijderen van de platen. Zodra de platen zijn verwijderd, gebruik maken van de smalle uiteinde van de hippocampus gereedschap om de resterende craniale zenuwen scheiden en schep de hersenen in de ijskoude Ca 2 +-vrij ACSF. Bereid de hersenen plakjes. Vanwege de kleinere omvang van de hersenen van muizen, het ontleden van de hippocampus kan een beetje meer uitdagende (maar zeker goed te doen) dan bij het gebruik van ratten. Dus, om dingen makkelijker te maken, verwijderen we het cerebellum en de rostrale tips van de frontale kwabben, maar niet ontleden de hippocampus. In plaats daarvan worden hersenhelften fysiek van elkaar gescheiden met een scalpel en intact gelaten voor Vibratome snijden (zie onder 4). 4. Sectie hersenweefsel in plakjes met behulp van een trillende Microtoom (Vibratome) en Transfer naar Holding kamer * Vul het reservoir van de Vibratome met ijs-koud Ca 2 +-vrij ACSF, zodanig dat de uitsnijden en het blad volledig ondergedompeld. Voor het maken van rat plakjes, snijd de rostrale en caudale uiteinden van elk hippocampus met een scalpel. Deze bezuinigingen zal u toelaten om verticaal de positie van de hippocampus nauw samen als twee kolommen. Dit werkt het beste als de dentate gyrus van elk hippocampus is tegenover elkaar en CA3 regio's zijn georiënteerd in dezelfde richting. Voor het maken van de muis plakjes, verticaal positie elke hersenhelft nauw samen met de frontale kwabben naar beneden. Lijm hersenweefsel op een montage blok en over te dragen aan het snijden fase van de Vibratome. We meestal voor te bereiden ~ 400 uM secties voor synaptische fysiologie experimenten. Dunnere gedeelten moeten worden voorbereid als fluorescerende beeldvorming zal worden uitgevoerd (bijvoorbeeld onderzoek van Ca 2 + niveaus en transiënten). Verzamel plakjes met een brede bek pipet of een penseel # en overbrengen in een petrischaaltje met ijskoud Ca 2 +-vrij ACSF. * Gebruik van een Vibratome minimaliseert schade aan de bovenste en onderste oppervlakken van de slice en is zeker een aanrader voor studies die analyse van cellen in de buurt van de slice oppervlak (bijv. spanning klem en Ca 2 + imaging studies). Echter, goedkopere alternatieven beschikbaar zijn en geschikt zijn voor het genereren van schijfjes voor extracellulair fysiologie experimenten. We hebben gebruik gemaakt van een kleine zwaartekracht-gecontroleerde chopper 2,11 en een McIlwain Tissue Chopper 12 met goed succes. Voor this procedure hippocampus zijn geplaatst op een gefaseerde en coupes met een verticale chopper. Een borstel wordt gebruikt voor het plakken (een per keer) over te dragen aan een kleine holding schaaltje gevuld met ijskoude Ca 2 +-vrij ACSF. Een probleem met deze benadering is dat de hippocampus kan bewegen tussen de karbonades wat resulteert in ongelijke delen. Wees ook voorzichtig te verwijderen zoveel mogelijk witte stof, en vooral zo veel vaatstelsel, zo mogelijk voor hakken. Dit materiaal zal vasthouden aan de borstel, het scheermes, of beide, waardoor slice overdracht erg moeilijk en het vergroten van de kans op uitrekken of beschadiging van het weefsel. # Bij gebruik van een borstel, probeer dan de slice lengte-wise rust in de haren. Wikkelen de slice rond de borstel tip kan leiden tot onnodig weefsel stretching. Overdracht hersenen plakjes het aanhouden kamer waar ze badend in zuurstof Ca 2 +-bevattende ACSF. Geleidelijk aan de kamer temperatuur van 27 ° tot 32 ° C (+1 ° om de vijf minuten). Laat plakjes te incubeer gedurende 1 tot 1,5 uur voor elektrofysiologische experimenten. 5. Ontlokken en Record CA3-CA1 Synaptic Reacties Voor basis extracellulaire opnames in acute plakjes, zal uw elektrofysiologie station moeten * zijn onder meer: een opname kamer, een perfusie-systeem, een microscoop met> 4x vergroting capaciteit; opname, stimulerend, en massa-elektroden, macro-en micromanipulators, een rigide vibratie-bestendige table-top en de kooi van Faraday, een stimulator, versterker en analoog-naar-digitaal (A / D) converter; oscilloscoop (bij voorkeur) en persoonlijke PC met de juiste acquisitie software. * Kerr Scientific Instruments biedt een fantastisch en goedkoop electrofysiologie systeem (dat wil zeggen de Kerr Tissue Recording System) voor het uitvoeren van een variëteit van basis slice elektrofysiologie experimenten. Dit systeem heeft een kleine footprint, draagbare stimulatoren en versterkers, en kan gebruikt worden op een standaard lab-bank zonder de noodzaak van een omvangrijke kooi van Faraday. Natuurlijk kan de hersenen plakjes ook worden gebruikt voor het uitvoeren van een groot aantal uitgebreide elektrofysiologische en beeldvormende technieken, die extra uitrusting en materialen zal vereisen. Bijvoorbeeld, onze belangrijkste elektrofysiologie station bevat een versterker met snelle spanning-en stroom-klem-mogelijkheden, een tl-verlichting systeem, en een digitale camera. Dit station wordt gebruikt voor het extracellulaire veldopnames in de hersenen plakjes, evenals patch-clamp opnamen en fluorescerende beeldvorming in plakjes en celculturen 3,12,13. Zie tabel 3 voor een volledige lijst van apparatuur en onderdelen. Met behulp van een brede mond pipet of kleine kwast, overdracht van een of meer plakjes om de opname kamer * waardoor het acclimatiseren voor 10-15 minuten voor de stimulatie / opname. Voor onze studies, worden ondergedompeld in plakjes ACSF en rusten op netting ingebracht in een RC-22 kamer door Warner Instruments (zie figuur 3). ACSF de zwaartekracht is gevoed door een regulator om debiet aan te passen, en voorverwarmd tot 32 ° C door een inline micro-heater voor het bereiken van de opname kamer. Een centrale stofzuiger lijn wordt gebruikt om ASCF te verwijderen. * Veel verschillende variëteiten van dompelpompen en interface-style opname kamers zijn commercieel verkrijgbaar. We hebben waargenomen dat schijfjes meer robuuste synaptische reacties vertonen in een interface kamer (dat wil zeggen slice zit aan een interface met bevochtigde lucht en ACSF) 2,11. Echter, responsiviteit is over het algemeen stabieler wanneer plakjes worden ondergedompeld in ACSF. Drug perfusie is ook efficiënter in onderdompeling kamers. Plaats stimulerende en registrerende elektroden. Met de stimulator of stimulus isolator is ingeschakeld, maar de output gekozen tot 0, de positie van een elektrode op het schijfje in het stratum radiatum regio van CA2 de buurt van de CA3 grens (zie figuur 4). We maken gebruik van een gedraaide platina iridium draad tot 50-100 uS difasisch pulsen te leveren aan CA3 Schaffer onderpand (SC) vezels. Het gebruik van platina iridium draad en difasisch pulsen kunnen helpen geminimaliseerd elektrode polarisatie. Lagere een registratie-elektrode in de CA1 stratum radiatum, maar het breken van de oppervlakte van de slice. Onze registratie-elektrode is een Ag / AgCl draad in een ACSF gevuld glas micropipet (tip weerstand van ~ 7 MΩ). Draai de uitgang van de stimulator tot een matig niveau (we onze stimulans isolator tot ~ 150 uA) en beginnen toedienen stimulans peulvruchten en het verwerven van activiteit met behulp van aanschaf software, zoals Clampex van Axon Instruments, Inc langzaam lager de elektrode in kleine intervallen tot een stimulus artificact is opgenomen in CA1. Vervolgens langzaam blijven verlagen zowel de stimulerende en registrerende elektroden in intervallen, terwijl het verwerven van CA1 reacties totdat de vezel volley (FV) en de prikkelende postsynaptische potentiaal (EPSP) amplitudes bereiken hun maximale niveaus (zie Figuur 4B). Stel een synaptische kracht curve en te onderzoeken synaptische plasticiteit. Voor het genereren van een synaptische kracht curve, leveren stimulans pulsen om SC op steeds hogere intensiteiten en opnemen van ee desbetreffende activiteit in CA1. Het bereik en het aantal gebruikte stimulus intensiteit niveaus kan variëren, maar moet voldoende zijn om een sigmoïdale curve genereren wanneer uitgezet tegen zowel FV of EPSP waarden (figuur 5). De FV amplitude zorgt voor een betrouwbare schatting van het aandeel van geactiveerde presynaptische vezels, terwijl de EPSP helling biedt een ongerepte maat voor monosynaptic CA3-CA1 stromen. Het plotten van de EPSP helling tegen de FV over stimulus intensiteitsniveaus weerspiegelt dan ook de grootte van het EPSP per aantal geactiveerde afferentia en biedt een uitstekende schatting van CA3-CA1 synaptische sterkte. Meestal worden synaptische sterkte niveaus aanzienlijk verminderd in het gebied CA1 van oude ratten en muizen APP/PS1, dan bij jonge ratten en leeftijd gematchte wild-type muizen zie bijvoorbeeld 4,14. Schijfjes die tekenen van slechte gezondheid (dat wil zeggen een maximale EPSP amplitude <1 mV) of hyperexcitabiliteit (dwz de verschijning van twee of meer inwoners spikes) laten zien tijdens de synaptische kracht curve zijn uitgesloten van de statistische analyse (zie Figuur 4C). We hebben gevonden dat deze schijfjes zelden stabiel reacties vertonen in een 60 minuten periode en / of vertonen een zeer variabel reacties na de inductie van synaptische plasticiteit. Het verdient op te merken dat "ongezond plakken" make-up slechts ongeveer 10-20% van alle segmenten overgebracht naar de opname kamer. Bovendien is in onze ervaring, de frequentie van het identificeren van een ongezonde slice is zeer vergelijkbaar in leeftijd, soort en genotype. Veroorzaken op lange termijn potentiatie (LTP) of lange termijn depressie (LTD) in plakjes. LTP en LTD zijn blijvende stijgingen (LTP) en neemt af (LTD) in de synaptische functie in reactie op de verschillende patronen van synaptische activatie. Beide processen wordt algemeen aangenomen dat kritische mechanismen voor het leren en memory15 reflecteren en nuttig resultaat maatregelen voorzien voor het onderzoeken van cellulaire mechanismen van neurale disfunctie en / of voor het beoordelen van farmacologische strategieën voor het verbeteren van het geheugen tekorten en neurodegeneratie 16. Voor de synaptische plasticiteit experimenten, reset de stimulus intensiteit voor alle plakjes van 1 mV * en beginnen baseline stimulatie bij een frequentie van 0.033 Hz. EPSP helling waarden moeten stabiel te zijn gedurende tenminste 20 minuten voor de inductie van LTP en LTD. Nauwlettend te volgen EPSPS in deze tijd en reset van de stimulus intensiteit als de helling fluctueert meer dan 10% en start een nieuwe baseline. Veroorzaken LTP met behulp van een een tweede trein van 100 Hz stimulatie of meerdere korte stoten (~ 10 pulsen) van 100 Hz stimulatie gegeven om de 200 ms. Voor LTD inductie, leveren 900 stimulus pulsen met een snelheid van 1 Hz. Na inductie van LTP of LTD, verzamel synaptic antwoorden voor een extra 60 minuten of meer. EPSP helling waarden verkregen voor en 60 min na hoge / lage frequentie stimulatie worden vergeleken met de aanwezigheid van LTP en LTD te bepalen. Leeftijd van ratten en muizen APP/PS1 hebben de neiging om een tekort LTP en LTD verbeterd (zie figuur 5) laten zien, en deze wijzigingen zijn voorgesteld om tot een verminderde cognitie bij te dragen in deze dierlijke modellen 6,16. Echter, in tegenstelling tot APP/PS1 muizen, veranderingen in de LTP / LTD in oude ratten zijn variabel over de labs. Oude ratten vertonen over het algemeen vergelijkbaar LTP niveau in vergelijking met volwassenen in reactie op "intense" (dwz 100 Hz) stimulatie, maar vertonen tekorten bij het mildere stimulatie parameters worden gebruikt (dat wil zeggen een lagere stimulus frequenties of minder stimulus pulsen) (voor review zie 4,6, 16). Ook hebben sommige labo's, waaronder de onze, waargenomen verhoogde gevoeligheid voor LTD inductie in oude ratten 2,17-19, terwijl andere groepen vonden geen verschil of een verminderde gevoeligheid in hun oude dieren. Zoals besproken hieronder kort (zie Overleg), kunnen subtiele maar kritische verschillen in experimentele protocol account voor deze verschillen. * De stimulatie-intensiteit en de EPSP amplitude van invloed kunnen zijn LTP inductie en kan een belangrijke oorzaak van de afwijkende resultaten in de literatuur. Dit zal verder worden overwogen in de discussie sectie. 6. Representatieve resultaten Ons werk, en werk van andere groepen, suggereert dat veranderingen in de astrocyten op basis van inflammatoire signalering kunnen veroorzaken en / of bespoedigen neurologische dysfunctie bij het ouder worden en AD 13,20,21. Onlangs hebben we gebruik gemaakt synaptische kracht, LTP en LTD als eindpunt maatregelen om de effectiviteit en werkingsmechanismen van verschillende nieuwe anti-inflammatoire reagentia in het midden-leeftijd APP/PS1 muizen (zie 22 voor een beschrijving van dit model) te onderzoeken en de leeftijd Fischer 344 ratten. De resultaten hieronder zijn verkregen met behulp van de protocollen beschreven in dit artikel. Een van de nieuwe anti-inflammatoire adeno-geassocieerde virale (AAV) reagentia ontwikkeld door ons laboratorium is aangetoond in pilot-studies aanzienlijk te vergroten synaptische sterkte (p <0,05) en LTP tekorten (p <0,05) te voorkomen in het midden-leeftijd (16 -maanden-oud) APP/PS1 muizen (n = 4-6 sneetjes per behandeling aandoening). Vertegenwoordiger van synaptische sterkte bochten en LTP experimenten van twee verschillende schijven, collected van dezelfde 16-maanden-oude APP/PS1 muis, zijn weergegeven in figuur 5A-C. Een plakje was uit het halfrond die behandeld worden met onze nieuwe AAV (reagens A), terwijl de andere plak werd behandeld met een controle AAV reagens (Control). LTP werd geïnduceerd in beide plakken met behulp van twee 1 sec treinen van 100 Hz stimulatie (10 sec intertrain interval). Merk op dat de synaptische kracht curve voor de Reagens A-behandelde slice is verschoven naar de linkerkant van de controle-slice, indicatief voor een grotere synaptische sterkte. Merk ook op dat, typisch voor de mid-leeftijd APP/PS1 muizen, LTP snel vervallen tot baseline in de controle-slice (bijv. 23). Omgekeerd LTP vervallen weinig in de slice die behandeld worden met onze nieuwe reagens. In een tweede recente studie, zagen we grote LTD in het voertuig behandelde oude ratten (85% van de pre-LTD baseline, p <0,05). In tegenstelling, was er geen LTD waargenomen in de leeftijd van ratten behandeld met nieuwe anti-inflammatoire "Drug A" (97% van de pre-LTD baseline, niet significant). Geen medicijn effecten op de synaptische sterkte waargenomen. Vertegenwoordiger LTD experimenten uit deze dataset (n = 8-10 ratten per groep) worden geïllustreerd in figuur 5D-F. Figuur 1. Gereedschappen en materialen die worden gebruikt voor de hersenen dissectie. A, een papieren handdoek. B, scalpel. C, Beebee schaar. D-, bot-rongeurs (voor ratten). E-, bot-rongeurs (voor muizen / ratten). F, plastic lepel. G, plastic transferpipet. H, hippocampus tool. Ik, spatel. J, chirurgische schaar. K, glazen petrischaal. Figuur 2. Aangepaste hersenen slice holding kamer. A, macrochamber. B, deksel. C, H 2 O reservoir met geperforeerde silicone. D, microchamber. E, ACSF levering buis (polyethyleen). F, O 2 aflevering buis. G, de haven voor de temperatuurregeling. H, gesaldeerd microchamber te voegen. Figuur 3. RC22 onderdompeling kamer. A, Opname kamer. B, Ground elektrode. C, aspiratie naald. Figuur 4. Hippocampus slice illustratie en extracellulaire golfvormen. A, Cartoon van een dwarse hippocampus groep die gebruikt zijn in de elektrofysiologie experimenten. CA = Cornu Ammonis. DG = dentate gyrus. SC = Schaffer collateralen. S radiatum = stratum radiatum. B, Elektrische stimulatie van de SC (een CA3 axon-darmkanaal), een stimulus artefact uitlokt, bijna onmiddellijk gevolgd door een presynaptische bevolking piek, of glasvezel volley (FV). De amplitude van FV is recht evenredig met het aantal geactiveerde SC vezels. De helling van de negatieve lopende fase van het veld prikkelende postsynaptische potentiaal (EPSP) komt overeen rechtstreeks aan de activering van depolariserende synaptische stromingen in de CA1 piramidale neuronen in reactie op de release van SC terminals glutamaat. C, Overlappende vertegenwoordiger extracellulaire golfvormen opgenomen in CA1 stratum radiatum in reactie op negen verschillende stimulus intensiteit niveaus (30 tot 500 uA) in een "gezonde" (linker paneel), "ongezond", en "hyperexciteerbare" slice. Vijf golfvormen werden gemiddeld per niveau. Gezonde schijfjes dynamisch in te spelen over deze stimulans serie en vertonen een positieve lopend populatie spike (als gevolg van CA1 neuronale ontladen) bij de hogere stimulus niveaus. In de RC22 onderdompeling kamer, maximale EPSPS meestal liggen tussen 1,5 en 3 mV in amplitude. Ongezonde plakjes (middelste paneel) vertonen vaak een grote FV, maar een kleine maximale EPSP (<1 mV) en meestal een slechte plasticiteit. Hyperexciteerbare plakken (rechter paneel) tonen twee of meer regeneratieve bevolking pieken in de opgaande onderdeel van de EPSP. Reacties in hyperexciteerbare schijfjes zijn vaak labiel en zijn variabel beïnvloed door LTD / LTP stimulatie. Figuur 5. Vertegenwoordiger elektrofysiologie experimenten uitgevoerd op acute plakjes van half-jaar (16 mnd) APP/PS1 muizen en ouder (22 MOS) Fisher 344 ratten. Panels AB show data verzameld van APP/PS1 muizen behandeld met een controle adeno-geassocieerde (AAV) virale construct (Control) of een roman AAV reagens (reagens A) die is ontwikkeld door ons lab groep. Ten opzichte van de controle-slice, de slice behandeld met Reagens A vertoont een duidelijke verschuiving naar links in de EPSP: FV curve (A) indicatie van een grotere synaptische sterkte. Het reagens-A-behandelde slice toont ook robuust en stabiel LTP (B) na de levering van twee 1 sec, 100 Hz stimulus treinen, terwijl de controlegroep slice vertoont een tekort LTP, typerend voor dit diermodel. Panelen DF show data verzameld van twee individuele oude ratten die chronisch (4 week) intrahippocampal perfusie van het voertuig of van een nieuwe anti-inflammatoire middelen (Drug A) ontvangen. Basale synaptische kracht werd relatief weinig beïnvloed door behandeling met geneesmiddelen(D). Echter, Drug A werd zeer effectief bij het voorkomen van de inductie van LTD (E). Panelen C en F tonen vertegenwoordiger EPSP golfvormen opgenomen van afzonderlijke segmenten voor (pre) en 60 min na (post) de levering van LTP / LTD stimulatie. Merk op dat stimulus artefacten niet worden weergegeven.