Summary
Wachsende etwas Flachs Sorten unter Nährstoff-Stress führt zu genomischen Variation innerhalb einer Teilmenge der Genom-und phänotypische Variation. Eine komplexe Insertion an einem bestimmten Ort ist mit einem Wachstum unter verschiedenen Nährstoffe Regimes und mit Veränderungen in der Genexpression um diese Site verknüpft ist.
Abstract
Einige Flachs Sorten Nährstoff Stress reagieren, indem Sie ihr Genom und diese Änderungen können über viele Generationen vererbt werden. Auch bei diesen genomischen Veränderungen verbunden sind vererbbare phänotypische Variationen 1,2. Der Flachs Vielzahl Stormont Cirrus (Pl), wenn sie unter drei verschiedenen Nährstoffen Bedingungen angebaut werden entweder bleiben induzierbarer (unter der Kontrolle Bedingungen), oder werden stabil geändert, um die große oder kleine genotroph durch das Wachstum bei hohen oder niedrigen Nährstoff-Bedingungen jeweils entweder. Die Linien, die sich aus der anfänglichen Wachstum unter jeder dieser Bedingungen scheinen besser wachsen, wenn unter den gleichen Bedingungen in den nachfolgenden Generationen gewachsen, vor allem die Pl Linie wächst am besten unter der Kontrolle der Behandlung darauf hinweist, dass die Pflanzen sowohl unter den hohen und niedrigen Nährstoffe unter sich Stress. Einer der genomischen Veränderungen, die mit der Induktion von vererbbaren Veränderungen verbunden sind, ist das Auftreten von ein Einsatzelement (LIS-1) 3, 4, während die Pflanzen unter den Nährstoff Stress wächst. Im Hinblick auf diese Insertion, der Flachs Vielzahl Stormont Cirrus (Pl), wenn sie unter drei verschiedenen Nährstoffen Bedingungen angebaut werden entweder unverändert bleiben (unter der Kontrolle Bedingungen), die Einfügung in alle Pflanzen erscheinen (bei geringen Nährstoffen) und haben diese übertragen an die nächste Generation, oder das Einfügen (oder Teile davon) erscheinen, aber nicht über Generationen (unter hohem Nährstoffe) 4 übertragen werden. Die Häufigkeit des Auftretens dieser Einfügung zeigt an, dass es unter positiver Selektion, die auch im Einklang mit dem Wachstum Reaktion in den nachfolgenden Generationen ist. Blätter oder Meristeme in den verschiedenen Stadien des Wachstums geerntet werden für die DNA-und RNA-Isolierung verwendet. Die RNA wird verwendet, um Unterschiede in der Expression mit den verschiedenen Wachstums-Umgebungen und / oder t er Anwesenheit / Abwesenheit von LIS-1 assoziiert zu identifizieren. Die isolierte DNA wird verwendet, um die Anlagen, in denen das Einsetzen aufgetreten identifizieren.
Protocol
1. Das Wachstum der Flachs unter induzierenden Bedingungen.
- 5 "Töpfe mit Erde gefüllt und bestätigt.
- Drei Samen pro Topf gepflanzt ¼ Zoll tief und der Boden gefestigt über die Samen.
- Die Töpfe werden dann mit 100 ml der entsprechenden Nährlösungen getränkt
- Die nicht-induzierende Kontrolle (C) Bedingungen mit einem 1 / 10 th Stärke Miracle-Gro jede Woche. Der hohe Nährstoffgehalt Zustand (NPK-Behandlung) war voller Stärke Miracle Wachsen angewandt wöchentlich. Low Nährstoff - Pflanzen hatten nur Leitungswasser während ihres Wachstums eingesetzt. (Durrant 1971, Cullis 1980).
- Die Pflanzen sind unter natürlichem Licht im Sommer gewachsen. Im Winter sind sie unter Natrium-Lampen mit einer 16 / 8 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus entwickelt.
- In wöchentlichen Abständen Blätter und Meristeme gesammelt werden.
- Das Pflanzenmaterial ist schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Ergebnisse
Die drei Genotypen wachsen bei unterschiedlichen relativen Preise abhängig von den Bedingungen (Abbildung 1). Deshalb unter Kontrollbedingungen der Pl Linie wächst am besten mit L als kräftiger als S (Abbildung 1a). Bei schwachem Nährstoffe (Wasser), wächst S besser als entweder L oder Pl (Abb. 1b). Unter hohem Nährstoffgehalt (NPK) L wächst besser als Pl, die wächst nur geringfügig besser als S (Abbildung 1c). Ein Vergleich zwischen den einzelnen Linien unter den drei unterschiedlichen Behandlungen gewachsen ist in Abbildung 1 d gezeigt - f. Pl wächst am besten unter Kontrollbedingungen (Abbildung 1d), L am besten unter hohen Nährstoffgehalt (Abbildung 1e) und S ebenfalls sowohl unter hohen Nährstoff-und Kontrollbedingungen (Abbildung 1f).
Diese Daten zeigen, dass die drei Linien auf der Grundlage ihres Wachstums unter den drei Umgebungen unterschieden werden können. Zu beachten ist, dass Pl besten wächst unter der Kontrolle Bedingungen während L wächst am besten unter der NPK Bedingungen (unter denen es induziert wurde). S wächst etwa die gleiche in allen drei Bedingungen, das heißt, es ist nicht in der Lage, die Vorteile der verbesserten Nährstoff-Bedingungen stattfinden, sondern ist besser in der Lage, unter sehr nährstoffarmen Bedingungen wachsen.
Das Wachstum Parameter, die für die Differenzierung der Pflanzen sind auch die Höhe der Pflanze (und damit verbunden die Internodienlänge, dass der Abstand zwischen jedem Blatt ist), das Blatt Größe und dem Grad der Verzweigung. Für Pl unter Kontrollbedingungen der Anlage ist groß mit Niederlassungen und die Blätter sind groß und dunkelgrün. Bei schwachem Nährstoffe der Pflanze sehr kurz ist, ist der Abstand zwischen jedem Blatt auch sehr kurz und die Blätter sind klein und hellgrün. Die Blätter an der Spitze sind dunkler grün als die weiter unten den Stamm. Unter hohem Nährstoffe der Pflanze sehr ähnlich sieht, dass unter Kontrolle, außer dass beide den Hauptstamm und die Seitentriebe kürzer als in der Kontroll-Pflanzen sind. Für die große genotroph die Pflanzen sehen sich sehr ähnlich zu denen von Pl, außer dass das stärkste Wachstum in unter hohem Nährstoffe. Auch bei geringen Nährstoffe der Pflanze ist sehr kurz und hat hellgrüne Blätter. Die S genotroph wächst ähnlich wie in allen drei Umgebungen, obwohl die Blätter leichter grün sind unter den niedrigen Nährstoffe. Doch in den nährstoffarmen Bedingungen der S genotroph ist viel kräftiger als die beiden Pl oder L-Linien.
2. RNA-und DNA-Extraktion aus Flachs Meristeme und Blätter sind separat erfolgen. Die Roche-Gesamt-RNA prep Kit wurde für die RNA-Extraktion und die Qiagen DNeasy Plant DNA Prep Kit wurde für die DNA-Extraktionen verwendet.
RNA-Extraktion
- 3 Meristeme sowie einige umliegende Blätter sind von der Lagerung Kryoröhrchen in Eppendorf-Röhrchen bewegt und platziert in flüssigem Stickstoff bis zur fertig geschliffen werden.
- Sterile Sand ist zu Röhrchen gegeben und Gewebe unter Verwendung einer Mikropistill bis gut.
- 400 ul Lyse / Bindungspuffer aus Roche Gesamt-RNA prep Kit zugegeben und Gewebe wird weiter an Boden, bis keine Klumpen zu sehen sind.
- Die Probe wird gevortext, 15 Sek. lang um Lyse Hilfe und dann versponnen für 1 min bei 13.000 rpm, um Sand und alle Ablagerungen sammeln.
- Der Überstand wird hinzugefügt, um Spalte Spin und den Rest der RNA prep Kit Anweisungen befolgt werden, wie verwiesen.
DNAse Behandlung
- 1 / 10 RNA-Probe von 10X DNAse-Puffer zugegeben.
- 30 Einheiten DNAse zugegeben und die Reaktion wird bei 37 ° C für 30 min und 70 ° C für 5 min.
Reverse Transkription
- Applied Biosystems RNA zu cDNA-Kit ist nach Richtungen, Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde und 95 ° C für 5 Minuten. Verwendet
Die cDNA wird dann in PCR oder für die qPCR eingesetzt
qPCR
qPCR wurde mit einem ABI Step One-System. Alle Assays wurden in dreifacher Ausführung auf jedem Lauf durchgeführt. Die Aktin-Gen wurde als Kopienzahl Kontrolle verwendetdie besten verfügbaren Housekeeping-Gen.
- Die entsprechende Primerpaar wurde zu jedem Röhrchen in 1μl aufgenommen.
- Die cDNA wurde auf die geeignete Konzentration und 9μl verdünnt hinzugefügt, um jedes Rohr
- 10 &mgr; l der 2x Power SYBR Green PCR Mastermix (ABI) und wurde in jedes Röhrchen gegeben
- Das Programm Verstärkung Programm war:
- 10 Minuten bei 95 ° C
- 40 Zyklen von 15sec bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C
Thermische Denaturierung der Amplifikation Spezifität zu überprüfen - Die relative Expression wurden durch den Wert von 2 (- CTactin CTunknown) bestimmt.
DNA-Präparation
- Buffer AP1 von Qiagen DNeasy Plant DNA Prep Kit ist auf 6 Blätter mit sterilem Sand in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufgenommen. Das Gewebe wird mit Mikropistill Boden, bis keine Klumpen zu sehen sind.
- Das Kit Anweisungen befolgt werden, wie verwiesen.
Ergebnisse
PCR-Amplifikation von DNA aus Blättern an verschiedenen Positionen entlang der Stammzellen isoliert zeigt, dass das Erscheinungsbild der LIS-1, während die Pflanzen unter induzierenden Bedingungen (4) wachsen auftritt. Der qPCR Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von LIS-1 (oder anderen genomischen Veränderungen mit der Induktion verbunden) die Expression von Genen beeinflusst in unmittelbarer Nähe der LIS-1 (Abbildung 2). Die sechs Gene in Abbildung 2 dargestellt sind alle unterschiedlich in Pl und S mit vier mit höheren Ausdruck in PL (ohne LIS-1) und zwei mit höheren Ausdruck in S (was LIS-1 haben) ausgedrückt. Panel 1 und 2 sind die beiden Gene am nächsten an der Einfügemarke der LIS-1. Die Expression dieser Gene s in den großen genotroph (die Änderungen bewogen hatte, aber nicht LIS-1) und die Expression unter verschiedenen Wachstumsbedingungen wird benötigt, um eine kausale Beziehung zwischen LIS-1 und der Gesichtsausdruck verändert sich zu bestimmen.
Abbildung 1. Pl, L und S unter drei verschiedenen Nährstoffen Regimes geworden. Panels a - Kontrolle, b - geringe Nährstoffe und c - NPK. d - Pl, e - S, f - L. Panels d - f von links nach rechts: low Nährstoffe, Kontrolle und NPK. D - Pl, e - L, F - S.
Abbildung 2. Genexpression um die Ansatzstelle des LIS-1. Gene 1 (Inhibitor des Wachstums) wird sofort 5 'LIS1 und das Gen 2 (Kip-bezogene Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor-ID 3 "des LIS-1. Die anderen Gene sind alle auf dem gleichen Gerüst (~ 500kb) aus dem eingebauten komplette Flachs Genomsequenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. PCR Amplifikationen von DNA aus einzelnen Blättern von Pflanzen von Stormont Cirrus unter nährstoffarmen Bedingungen angebaut extrahiert. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2% Agarose-TBE-Gel aufgetrennt. Die uninserted Standort Gremium wird gezeigt, sind die beiden Enden des eingefügten Seiten in Panels b und c gezeigt Blattproben von 1 bis 6 wurden in wöchentlichen Abständen mit Probe 1 wird frühestens nach der Aussaat isoliert.
Discussion
Flachs scheint ein instabiles Genom haben. Eine Reihe von kommerziellen Faserflachs Sorten schnell ungleichmäßig, wenn für ein paar Generationen gewachsen. Die gleichen Beobachtungen scheinen nicht zu halten für die Öl-Flachssorten wahr. Deshalb scheint es einen Zusammenhang zwischen der Wahl für Faserqualität und Genominstabilität werden. Die umweltbedingten vererbbare Veränderungen in Flachs wurden ursprünglich durch die Untersuchung der agronomischen Beobachtungen des Wachstums der Faser Ernte identifiziert. Diese wiederholbare Beobachtungen von spezifischen phänotypischen und genomische Varianten stellt sich die Frage, wie ökologische Belastung kann die Suite von genomischen Umlagerungen, die auftreten können beeinflussen. Das wiederholte Auftreten von LIS-1 in Reaktion auf bestimmte Umgebungen steht im Einklang mit dieser Mutation, die direkt oder indirekt gewählt. Das Wachstum der Linien durch verschiedene Behandlungen induzierten zeigt auch eine verbesserte Leistung im Rahmen der einschlägigen induzierenden Bedingungen. Die Veränderungen in der Expression auch mit der Anwesenheit von LIS-1 wieder verbunden zeigt, dass diese Insertion-Anlage die Leistung beeinträchtigen. Die Video-Präsentation bietet ein Forum zur Beobachtung der Pflanzen phänotypische Veränderungen in einer Art und Weise unmöglich, durch traditionelle gedruckte Material zu vermitteln.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
