Summary
גידול כמה סוגים פשתן תחת תוצאות מתח מזין וריאציה גנומית בתוך משנה של הגנום ושונות פנוטיפי. הכניסה מורכבים באתר מסוים מזוהה עם צמיחה תחת משטרי תזונה שונים עם שינויים בביטוי הגנים סביב באתר זה.
Abstract
כמה זנים פשתן להגיב ללחץ תזונתי על ידי שינוי הגנום שלהם שינויים אלה יכולים לעבור בתורשה דרך דורות רבים. קשור גם שינויים אלה הם גנטי תורשתי פנוטיפי 1,2 וריאציות. סטורמונט מגוון פשתן Cirrus (PL), כאשר גדל פי שלושה תנאים מזין שונים יכולים להישאר ועין מתנהלת (בתנאים שליטה), או להיות שונה ביציבות אל גם את genotroph גדול או קטן על ידי צמיחה בתנאים תזונתי גבוה או נמוך בהתאמה. הקווים וכתוצאה מגידול ראשוני תחת כל התנאים האלה מופיעים לגדול יותר כאשר גדל בתנאים זהים בדורות הבאים, בעיקר את הקו Pl גדל הטובה ביותר תחת טיפול הבקרה המצביע על כך הצמחים הגדלים תחת שני החומרים המזינים גבוה ונמוך נמצאים תחת הלחץ. אחד השינויים גנומית המשויכים אינדוקציה של תורשתי שינויים היא הופעתו של אלמנט הכניסה (LIS-1) 3, 4 בעוד הצמחים גדלים תחת הלחץ מזין. בהתייחס לאירוע זה הכניסה, סטורמונט מגוון פשתן Cirrus (PL), כאשר גדל פי שלושה תנאים מזין אחר יכול להישאר ללא שינוי (בתנאים שליטה), יש הכניסה מופיעים כל הצמחים (תחת מזינים נמוך) ויש להם זה מועבר לדור הבא, או לקבל את הכניסה (או חלקים ממנו) מופיעים אבל לא להיות מועבר מדור לדור (תחת מזינים גבוהה) 4. תדירות הופעתם של הכניסה זה עולה, כי היא תחת סלקציה חיובית, שגם היא עולה בקנה אחד עם התגובה גידול הדורות הבאים. עלים או meristems שנקטפו בשלבים שונים של צמיחה המשמשים לבידוד דנ"א רנ"א. RNA משמש לזיהוי וריאציה בביטוי הקשורים סביבות גידול שונים ו / או לא הוא נוכחות / היעדרות של LIS-1. ה-DNA בודד משמש כדי לזהות אותם צמחים אשר הכניסה התרחש.
Protocol
1. צמיחה של פשתן בתנאים גרימת.
- 5 "סירים מלאים באדמה firmed.
- שלושה זרעים לכל סיר נטועים ¼ אינץ עמוק באדמה firmed על הזרעים.
- סירים הם להשקות אז עם 100 מ"ל של פתרונות תזונה מתאימה
- ללא גרימת (ג) תנאי השליטה להשתמש כוח 1 / 10 ה Miracle-Gro מדי שבוע. מצב תזונתי גבוה (NPK הטיפול) היה נס כוח מלא לגדול להחיל שבועי. מזין נמוכה - צמחים רק מי ברז מיושם ברחבי הצמיחה שלהם. (Durrant 1971, Cullis 1980).
- הצמחים גדלים תחת אור טבעי במהלך הקיץ. בחורף הם גדלו תחת אורות נתרן עם מחזור אור / חושך 16 / 8 שעות.
- במרווחים שבועי עלים meristems נאספים.
- החומר צמח הוא קפוא מהירה בחנקן נוזלי.
תוצאות
שלושת גנוטיפים לצמוח בשיעורים יחסית שונה בהתאם לתנאי (איור 1). לכן בתנאים לשלוט קו Pl גדל בצורה הטובה ביותר עם L להיות נמרצת יותר S (איור 1 א). תחת מזינים נמוכה (מים), S גדל יותר או L או Pl (איור 1b). תחת תזונתי גבוה (NPK) L גדל יותר Pl שרק גדל מעט טוב יותר מאשר S (איור 1 ג'). השוואה בין כל השורות גדל פי שלושה טיפולים שונים מוצג באיור 1 ד - ו Pl גדל הטובה ביותר בתנאים הביקורת (איור 1d), L הטובה ביותר תחת תזונתי גבוה (איור 1e) ו-S דומה תחת מזין הן גבוהות ותנאים הביקורת (איור 1f).
נתונים אלו מראים כי שלושת הקווים יכול להיות מובחן על בסיס הצמיחה שלהם תחת שלוש סביבות. יש לציין כי Pl גדל בתנאים הטובים ביותר תוך שליטה L גדל הטובה ביותר בתנאים NPK (תחת אשר היה מושרה). S גדל על זהה בכל שלושת התנאים, כלומר, הוא אינו מסוגל לנצל את התנאים תזונתי משופר, אך הוא מסוגל יותר לגדול בתנאים תזונתי נמוך מאוד.
הפרמטרים צמיחה שרלוונטיות בידול של צמחים כוללים את גובה הצמח (הקשורים עם אורך זה internode, כלומר המרחק בין כל עלה), גודל העלה ואת מידת הסתעפות. עבור Pl בתנאים בקרה צמח גבוה עם ענפים ועלים ירוקים גדולים וכהים. תחת מזינים צמח נמוך הוא קצר מאוד, המרחק בין כל עלה גם הוא קצר מאוד העלים ירוק קטן וקל. העלים בקצה ירוקים כהים יותר מאלו למטה גזע. תחת מזינים גבוהה הצמח נראה דומה מאוד לזו בתנאים השליטה אלא גם את גזע הראשי יורה לוואי קצר יותר מאשר במפעלי שליטה. עבור genotroph הגדול הצמחים נראים דומים מאוד לאלה של Pl מלבד הגידול הנמרץ ביותר כי תחת מזינים גבוהה. שוב תחת חומרים מזינים צמח נמוך הוא קצר מאוד ויש לו עלים בצבע ירוק בהיר. Genotroph S גדל באופן דומה בכל שלושת סביבות למרות העלים ירוק בהיר תחת מזינים נמוכה. עם זאת, התנאים התזונתי נמוך genotroph S הרבה יותר נמרצת יותר משתי שורות Pl או L.
2. RNA ו-DNA עקירות מ meristems פשתן ועלים נעשים בנפרד. סך רוש RNA ערכת הכנה שימש עקירות RNA ו-DNA DNeasy Qiagen הצמח מכין ערכת שימש עקירות DNA.
הפקת רנ"א
- 3 meristems בתוספת כמה עלים סביב מועברים מן cryovial אחסון לתוך צינור Eppendorf והניח לתוך חנקן נוזלי עד מוכן להיות הקרקע.
- חול סטרילית מתווסף צינור רקמות הקרקע באמצעות micropestle עד דק.
- 400 תמוגה ul / חיץ מחייב מ רוש סך RNA ערכת הכנה נוסף ורקמות היא קרקע נוספת עד גושים לא גלויים.
- לדוגמה הוא vortexed במשך 15 שניות כדי לסייע תמוגה ואז הסתחרר דקות 1 בסל"ד 13,000 לאסוף חול וכל פסולת.
- Supernatant מתווסף ספין עמודה שאר הוראות הכנה RNA ערכת הם אחריו כמו מכוונת.
DNAse טיפול
- 1 / 10 נפח RNA מדגם של חיץ DNAse 10X הוא הוסיף.
- 30 יחידות של DNAse נוסף והתגובה היא מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו - 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
Reverse Transcription
- Applied Biosystems RNA לערכה cDNA משמש לכל הכיוונים, התגובה מודגרות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ו - 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
CDNA משמש אז PCR או qPCR
qPCR
qPCR בוצעה באמצעות מערכת אחת ABI שלב. כל מבחני בוצעו בשלושה עותקים על כל סיבוב. הגן אקטין שימש לשלוט עותק המספרמשק הבית הכי זמין גן.
- הצמד פריימר מתאים נוספה צינור כל 1μl.
- CDNA היה מדולל לריכוז 9μl מתאימים שנוספו צינור אחד
- 10μl של SYBR כוח 2x גרין PCR MasterMix (ABI) וכן נוספה צינור אחד
- התוכנית הגברה התוכנית:
- 10 דקות 95 ° C
- 40 מחזורים של 15sec ב 95 ° C, 1 דקות ב 60 ° C
Denaturation צעד תרמי לאמת סגוליות ההגברה - רמות הביטוי היחסי נקבעו על ידי הערך של 2 (CTunknown - CTactin).
ה-DNA הכנה
- מאגר AP1 מ Qiagen DNeasy הצמח DNA ערכת הכנה מתווסף 6 עלים עם חול סטרילי בתוך שפופרת microfuge. רקמה היא קרקע עם micropestle עד גושים לא גלויים.
- הוראות ערכת הן בעקבות ההנחיות.
תוצאות
הגברה PCR של ה-DNA שבודד יוצאת בשעה בתפקידים שונים לאורך גזע מוכיח כי המראה של LIS-1 מתרחשת כאשר הצמחים גדלים בתנאים גרימת (4). תוצאות qPCR מראים כי נוכחות של LIS-1 (או שינויים גנומיים אחרים הקשורים הזירוז) משפיע על הביטוי של גנים בסביבה הקרובה של LIS-1 (איור 2). ששת הגנים שמוצג באיור 2 הם כולם הביעו דיפרנציאלי עם ארבעה שיש ביטוי גבוה PL (ללא LIS-1) ושני שיש ביטוי גבוה S (אשר יש LIS-1) ב Pl ו-S. לוח 1 ו -2 הם שני הגנים הקרובים אל נקודת ההוספה של LIS-1. הביטוי של גנים אלה של ב genotroph גדול (אשר יש לו שינויים המושרה אבל אין LIS-1) ואת הביטוי בתנאי גידול שונים יהיה צורך לקבוע כל קשר סיבתי בין LIS-1 ואת השינויים ביטוי.
באיור 1. Pl, L ו-S גדל תחת שלושה משטרים שונים מזין. לוחות - שליטה ב - מזינים נמוכה ג - NPK. ד - Pl, דואר - S, ו - פאנלים ל ד - ו, משמאל לימין: מזינים נמוכה, מלאה NPK. D - Pl, e - L, F - ס
איור 2. Gene הביטוי סביב נקודת הכניסה של LIS-1. ג'ין 1 (מעכבי צמיחה) הוא מיד 5 "אל LIs1 ואת הגן 2 (קיפ הקשורות cyclin תלויי קינאז מעכב id 3" של LIS-1. הגנים האחרים הם כל הזמן הפיגום זהה (~ 500KB) בנוי מ להשלים רצף הגנום פשתן. אנא לחץ כאן כדי לראות דמות גדולה .
איור 3. Amplifications PCR של DNAs שחולצו מן העלים של צמחים בודדים של סטורמונט Cirrus גדל בתנאים תזונתי נמוך. המוצרים PCR הופרדו על ג'ל agarose-TBE 2%. האתר uninserted מוצג בלוח, שני קצוות של האתר מוכנס מוצגים לוחות B ו-C דגימות עלים 1-6 בודדו במרווחים שבועי עם מדגם 1 להיות הראשונה לאחר הזריעה.
Discussion
פשתן נראה הגנום יציב מטבעו. מספר זנים מסחריים סיבי פשתן הפך במהירות לא אחידה כאשר גדל במשך כמה דורות. התצפיות זהה לא נראה נכון גם לגבי זני שמן פשתן. לכן נראה שיש קשר בין הבחירה באיכות סיבים וחוסר יציבות הגנום. המושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן זוהו במקור דרך החקירה של תצפיות אגרונומית הצמיחה של היבול סיבים. תצפיות אלה הדיר של וריאציות פנוטיפי ו גנומית ספציפית מעלה את השאלה כיצד ולחץ סביבתי יכול להשפיע על חבילה של rearrangements גנומית שעלול להתרחש. המראה חוזרות ונשנות של LIS-1 בתגובה בסביבות מסוימות עולה בקנה אחד עם מוטציה זו להיות במישרין או בעקיפין שנבחר. הצמיחה של קווי המושרה על ידי טיפולים שונים גם מצביע על ביצועים משופרים בתנאים גרימת הרלוונטיים. שינויים בביטוי קשור גם עם נוכחותם של LIS-1 שוב מציין כי הכניסה הזאת להשפיע על ביצועי הצמח. מצגת וידאו מספק פורום התבוננות שינויים צמח פנוטיפי בצורה בלתי אפשרי להעביר דרך החומר המודפס המסורתי.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
