Summary
El cultivo de algunas variedades de lino en los resultados de estrés de nutrientes en la variación genómica dentro de un subconjunto del genoma y la variación fenotípica. Un complejo de inserción en un sitio específico se asocia con un crecimiento bajo diferentes regímenes de nutrientes y con los cambios en la expresión génica en torno a este sitio.
Abstract
Algunas variedades de lino responden al estrés de nutrientes mediante la modificación de su genoma y estas modificaciones pueden ser heredadas a través de muchas generaciones. También se asocia con estos cambios genómicos son heredables 1,2 variaciones fenotípicas. La variedad de lino Stormont Cirrus (Pl) cuando se cultivan bajo tres condiciones diferentes de nutrientes puede seguir siendo inducible (en las condiciones de control), o ser modificado de forma estable ya sea a la genotroph grande o pequeño por el crecimiento en condiciones de nutrientes de alta o baja, respectivamente. Las líneas que resultan del crecimiento inicial en cada una de estas condiciones parece que crecen mejor cuando se cultivan en las mismas condiciones en las generaciones posteriores, sobre todo la línea de Pl. crece mejor en el tratamiento de control que indica que las plantas que crecen en los alimentos, tanto de alta y baja se encuentran bajo el estrés. Uno de los cambios genómicos asociados con la inducción de cambios heredables es la aparición de un elemento de inserción (LIS-1) 3, 4, mientras que las plantas están creciendo bajo el estrés de nutrientes. Con respecto a este evento de inserción, el lino variedad Stormont Cirrus (Pl) cuando se cultivan bajo tres condiciones diferentes de nutrientes puede permanecer sin cambios (en las condiciones de control), que la inserción aparece en todas las plantas (en nutrientes bajo) y han transmitido esta a la siguiente generación, o la inserción (o partes de él), pero no parece ser transmitido de generación en generación (en los alimentos de alto) 4. La frecuencia de la aparición de esta inserción indica que está bajo la selección positiva, que también es consistente con la respuesta de crecimiento en las generaciones posteriores. Hojas o meristemas cosechan en las distintas etapas de crecimiento se utilizan para el ADN y el aislamiento de ARN. El ARN se utiliza para identificar las variaciones en la expresión asociada con el crecimiento de diversos ambientes y / o L a presencia / ausencia de LIS-1. El ADN aislado se utiliza para identificar las plantas en las que la inserción se ha producido.
Protocol
1. El crecimiento de lino bajo condiciones de inducción.
- 5 "macetas llenas de tierra y firme.
- Tres semillas por maceta se plantan ¼ de pulgada de profundidad y el suelo firme sobre las semillas.
- Las macetas se regaron con 100 ml luego de las soluciones de nutrientes apropiados
- La no inducción de control (C) las condiciones de uso una fuerza de 1 / 10 de Miracle-Gro cada semana. La condición de alta de nutrientes (NPK tratamiento) había Milagro toda su fuerza crece aplica semanalmente. Bajos de nutrientes - las plantas sólo había agua corriente aplicada a lo largo de su crecimiento. (Durrant 1971, Cullis, 1980).
- Las plantas se cultivan bajo la luz natural durante el verano. Durante el invierno se cultivan bajo las luces de sodio con un 16 / 8 horas de luz / oscuridad ciclo.
- A intervalos semanales hojas y meristemas se recogen.
- El material vegetal es rápido congelado en nitrógeno líquido.
Resultados
Los tres genotipos crecen en diferentes tipos de relación en función de las condiciones (Figura 1). Por lo tanto, bajo condiciones de control de la línea Pl crece mejor con L está más vigoroso que el S (Figura 1a). En bajos nutrientes (agua), S crece mejor que L o Pl (Figura 1b). En nutrientes de alta (NPK) L crece mejor que Pl que sólo crece un poco mejor que S (Figura 1c). Una comparación entre cada una de las líneas de crecimiento en los tres diferentes tratamientos se muestra en la Figura 1 d - f. Pl crece mejor en condiciones control (Figura 1d), en el mejor L en nutrientes de alto (Figura 1e) y S de manera similar en ambos nutrientes de alta y las condiciones de control (Figura 1 F).
Estos datos muestran que las tres líneas se pueden diferenciar en función de su crecimiento en los tres ambientes. Es de notar que Pl crece mejor en las condiciones de control, mientras que L crece mejor en las condiciones NPK (en las que se indujo). S crece más o menos igual en las tres condiciones, es decir, no es capaz de tomar ventaja de la mejora de las condiciones de nutrientes, pero es más capaz de crecer en condiciones de nutrientes muy baja.
Los parámetros de crecimiento que son relevantes para la diferenciación de las plantas incluyen la altura de la planta (y asociado con esta longitud de los entrenudos, la que es la distancia entre cada hoja), el tamaño de la hoja y el grado de ramificación. Pl. de las condiciones de control de la planta es alto con ramas y las hojas son verdes grandes y oscuros. En bajos nutrientes de la planta es muy corto, la distancia entre cada hoja también es muy corto y las hojas son de color verde pequeño y ligero. Las hojas en la punta son un verde más oscuro que los niveles inferiores de la madre. En virtud de los nutrientes de la planta alta es muy similar al que en las condiciones de control, excepto que tanto el tallo principal y las ramas laterales son más cortas que en las plantas de control. Para los grandes genotroph las plantas son muy similares a los de Pl, excepto que el crecimiento más vigoroso en menos de nutrientes de alta. Una vez más en nutrientes bajo la planta es muy pequeña y tiene hojas de color verde. El genotroph S crece de manera similar en los tres entornos, aunque las hojas son de color verde claro en los nutrientes de baja. Sin embargo, en las condiciones de nutrientes bajo la genotroph S es mucho más fuerte que cualquiera de las líneas L o Pl.
2. ARN y las extracciones de ADN a partir de los meristemas de lino y las hojas se hacen por separado. La Roche ARN total kit de preparación se utilizó para la extracción de ARN y el ADN de Qiagen DNeasy Planta de preparación kit se utilizó para la extracción de ADN.
La extracción de RNA
- 3 meristemos además de algunas hojas se mueven alrededor de criovial de almacenamiento en un tubo eppendorf y se colocaron en nitrógeno líquido hasta que esté listo para ser molido.
- Arena estéril se añade al tubo y el tejido es un terreno con un micropestle hasta bien.
- Lisis 400 ul / tampón de unión de Roche ARN total kit de preparación, se añade y el tejido es más terreno hasta que no haya grumos visibles.
- De la muestra se agita durante 15 segundos para ayudar a la lisis y luego girar durante 1 minuto a 13.000 rpm para recoger residuos de arena y cualquier.
- Sobrenadante se añade a girar la columna y el resto de las instrucciones del ARN kit de preparación son seguidas como se indica.
DNAsa tratamiento
- 1 / 10 volumen de muestra de RNA de 10X buffer DNAsa se añade.
- 30 unidades de DNAsa se añade y la reacción se incuba a 37 ° C durante 30 min y 70 ° C durante 5 min.
La transcripción inversa
- Applied Biosystems ARN a ADNc kit se utiliza según las instrucciones, la reacción se incuba a 37 ° C durante 1 hora y 95 ° C durante 5 minutos.
El cDNA se utiliza en la PCR o por qPCR
qPCR
qPCR se realizó utilizando un ABI Paso Uno de los sistemas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado en cada ejecución. El gen de la actina se utilizó como control el número de copias comola mejor limpieza de genes disponibles.
- El primer par adecuado se añadió a cada tubo en 1μl.
- El cDNA se diluyó a la concentración apropiada y 9μl añadido a cada tubo
- 10μl de la energía 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) y se añadió a cada tubo
- El programa de amplificación programa:
- 10 minutos a 95 ° C
- 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C, 1 min a 60 ° C
Paso de desnaturalización térmica para verificar la especificidad de amplificación - Los niveles relativos de expresión se determina por el valor de 2 (CTunknown - CTactin).
Preparación del ADN
- Buffer AP1 de Qiagen DNeasy planta de preparación de ADN kit se añade a 6 hojas con arena estéril en un tubo de microcentrífuga. El tejido se tritura con micropestle hasta que no haya grumos visibles.
- Las instrucciones del juego son seguidas como se indica.
Resultados
Amplificación por PCR a partir del ADN aislado de las hojas en varias posiciones a lo largo de la madre demuestra que la aparición de la LIS-1 se produce cuando las plantas están creciendo bajo condiciones de inducción (4). Los resultados qPCR muestran que la presencia de la LIS-1 (u otros cambios genómicos asociados con la inducción) afecta a la expresión de genes en las inmediaciones de la LIS-1 (Figura 2). Los seis genes se muestra en la Figura 2 son expresados diferencialmente en Pl y S con cuatro tienen mayor expresión en el PL (sin LIS-1) y dos con una mayor expresión de S (que tiene LIS-1). Grupo 1 y 2 son los dos genes más cercano al punto de inserción de la LIS-1. La expresión de estos genes en el s genotroph grandes (que ha tenido cambios inducidos pero no tiene LIS-1) y la expresión bajo diferentes condiciones de crecimiento va a ser necesaria para determinar una relación causal entre el LIS-1 y los cambios de expresión.
Figura 1. Pl, L y S crecido bajo tres regímenes diferentes de nutrientes. Paneles de un - control, b - c bajo y nutrientes - NPK. d - Pl, e - S, f - L. paneles d - f de izquierda a derecha: bajos nutrientes, el control y NPK. D - Pl, e - L, M - S.
Figura 2. La expresión de genes alrededor del punto de inserción de la LIS-1. Gen 1 (inhibidor del crecimiento) es inmediatamente 5 'del gen LIS1 y 2 (Kip relacionados dependiente de ciclina Identificación del inhibidor de la quinasa 3 "de la LIS-1. Los genes de otros a lo largo del mismo andamio (~ 500kb) construido a partir de la secuencia completa del genoma de lino. Por favor, haga clic aquí para ver una figura más grande .
Figura 3. Amplificaciones PCR del DNA extraído de las hojas de las plantas individuales de Stormont Cirrus crecido en condiciones de baja de nutrientes. Los productos de PCR fueron separados en un 2% de agarosa-TBE gel. El sitio uninserted se muestra en el panel, los dos extremos de la página insertada se muestran en los paneles B y C. Las muestras de hojas 1 a 6 fueron aislados en intervalos de una semana con una muestra de que las primeras después de la siembra.
Discussion
Lino parece que tiene un genoma intrínsecamente inestable. Un número de variedades comerciales de las fibras de lino rápidamente se convierten en no-uniforme cuando se cultiva por unas pocas generaciones. Observaciones mismo no parece válido para el variedades de aceite de linaza. Por lo tanto, no parece haber una asociación entre la selección de calidad de la fibra y la inestabilidad del genoma. El medio ambiente inducida cambios heredables en la linaza fueron identificados a través de la investigación agronómica de las observaciones del crecimiento de la cosecha de la fibra. Estas observaciones repetibles de determinadas variaciones fenotípicas y genómica plantea la cuestión de cómo el estrés ambiental puede influir en el conjunto de reordenamientos genómicos que pueden ocurrir. La aparición repetida de LIS-1 en respuesta a ambientes particulares es compatible con esta mutación está directa o indirectamente seleccionado. El crecimiento de las líneas inducida por diversos tratamientos también indica un mejor desempeño en las condiciones inducir pertinentes. Los cambios en la expresión también se asocia con la presencia de LIS-1 indica de nuevo que esta inserción afectar al rendimiento de la planta. La presentación de vídeo ofrece un foro para la observación de los cambios en la planta fenotípica de una manera imposible de transmitir a través de material impreso tradicional.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety denoted Pl and the genotrophs L and S. | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| Miracle-Gro | |||
| greenhouse | |||
| High pressure sodium lights | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mortar and pestles | |||
| Micropestles and microfuge tubes | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electrophoresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| StepOne qPCR module | |||
| Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit | |||
| Applied Biosystems RNA to cDNA kit | |||
| Roche total RNA prep kit |
References
- Durrant, A. The environmental induction of heritablel change in Linum. Heredity. 17, 27-61 (1962).
- Cullis, C. A. Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax. Heredity. 38, 129-154 (1977).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol. , 167-171 (2005).
- Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax. Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).
