בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Summary

פרוטוקול עבור בידוד והפעלת spermatids מן הזכר

Abstract

זכרים הרמפרודיטים הם שתי צורות המינית נמצא באופן טבעי נמטודות C. elegans. זרע amoeboid מיוצרים על ידי שני גברים הרמפרודיטים. בשלב מוקדם יותר של gametogenesis, בתאי הנבט של הרמפרודיטים להתמיין מספר מוגבל של הזרע - בערך 300 - ו מאוחסנים "תיק" קטן שנקרא spermatheca. מאוחר יותר, הרמפרודיטים הרף לייצר ביציות ^1. לעומת זאת, הזכרים מייצרים זרע רק לאורך הבגרות שלהם. הזכרים מייצרים זרע כל כך הרבה חשבונות עבור 50%> של תאים הכולל ² מבוגרים אופיינית תולעת. לכן, בידוד זרע מהזכרים קל יותר מזה של הרמפרודיטים.

רק אחוז קטן של גברים נוצרות באופן טבעי, בשל הפער הלא ספונטני של כרומוזום X ^3. מעבר הרמפרודיטים עם זכרים או בצורה נוחה יותר, את ההקדמה של מוטציות כדי להצמיח אותו (שכיחות גבוהה של זכרים) פנוטיפ כמה אסטרטגיות דרכו ניתן להעשיר את אוכלוסיית הגברים ^3.

זכרים ניתן להבחין בקלות על ידי התבוננות ⁴ מורפולוגיה הזנב הרמפרודיטים. הזנב של הרמפרודיט הוא הצביע, ואילו זנבו של הזכר הוא מעוגל עם מבנים ההזדווגות.

חיתוך הזנב משחרר מספר עצום של spermatids מאוחסן בתוך מערכת הרבייה של הגבר. Dissection מבוצע תחת מיקרוסקופ סטריאופוני באמצעות מחטים מד 27. מאז spermatids אינם מחוברים פיזית עם כל שאר התאים, הלחץ ההידראולי מגרשת תוכן פנימי של הגוף הגברי, כולל spermatids ^2.

הזכרים גזור ישירות על ירידה קטנה של "בינוני זרע". Spermatids רגישים שינוי ב-pH. לפיכך, HEPES, מתחם עם קיבולת חציצה טוב משמש בתקשורת הזרע. גלוקוז ומלחים אחרים מציגים בתקשורת זרע לסייע בשמירה על הלחץ האוסמוטי כדי לשמור על שלמות של הזרע.

פוסט meiotic בידול של spermatids לתוך זרע נקרא spermiogenesis או הפעלה הזרע. מנענע ^5, ונלסון ⁶ בעבר הראו כי spermatids עגול יכול להיגרם להתמיין זרע על ידי הוספת מרכיבים שונים, כולל הפעלת Pronase E. כאן אנו מדגימים במבחנה spermiogenesis של C. elegans spermatids באמצעות Pronase E.

Spermiogenesis מוצלח הוא מראש הנדרשים לצורך פוריות ומכאן מוטנטים פגום spermiogenesis הם עקרים. מספר מוטציות עד כה הוכחו פגום במיוחד בתהליך spermiogenesis ^7. חריגות שנמצאו במהלך בהפעלת במבחנה של הרומן SPE (spermatogenesis פגום) מוטנטים יעזור לנו לגלות שחקנים נוספים שהשתתפו באירוע.

Protocol

1) העשרה של האוכלוסייה הגברית

1. בהתאם לצורך הניסוי, מספר גדול של זכרים ניתן להשיג על ידי העסקת אחת האסטרטגיות הבאות:
   1. אוכלוסייה גדולה של גברים סוג בר ניתן להשיג על ידי המעבר 5 זכרים סוג בר 1 אנדרוגינוס על הדשא קטן של OP50 seeded במרכז צלחת NGM. בערך 50% של בני הדור שלאחר יהיה סוג הזכרים בטבע.
   2. אותו-5 (e1490) או אותו-8 (e1489) הרמפרודיטים לזרוק מספר רב של גברים. אותו-5 ו-8 לו זכרים פוריים ואין פגם ברור במורפולוגיה הזרע ותפקודו. לכן, אותו-5-8 או אותו הזכרים יכולים לשמש במקום הזכרים סוג בר ניסויים רבים.

2) זיהוי ובידוד של זכרים

1. בדוק את המורפולוגיה הזנב של תולעים, תולעת הזנב של הזכר הוא מעוגל.
2. פיק L4 הזכרים הבמה ולהעבירם seeded צלחת NGM עם E. coli OP50 ולתת להם לגדול במשך יום או יומיים. הזכרים מתנזר גידול בהעדר הרמפרודיטים למנוע אובדן של זרע ולכן מספר גדול של spermatids יהיה זמין במהלך הליך ניסיוני.
3. ביום לנתיחה, להעביר את הזכרים מתנזר על צלחת NGM ללא חיידקים ולתת להם לזחול בשביל כמה דקות. פעולה זו מסייעת להסיר שכבה קטנה של E. החיידק דבק על פני השטח של תולעים. לחלופין, נפח פיפטה קטנה של M9 חיץ (6 גרם Na ₂ HPO _4, 3G KH ₂ PO _4, 5 גרם NaCl, 0.25g MgSO ₄ 0.7 H ₂ O לליטר) בכוס לצפות הזכרים להעביר לתוך המאגר.

3) Dissection של הזכרים והן הפעלה חוץ גופית

1. קח שקופיות הזכוכית לסמן עיגול קטן באמצעות עט פאפ. פיפטה 30-50 μl של זרע בינוני 1X (HEPES 50mm, 25mm KCl, NaCl 45mm, 1mm MgSO _4, 5 מ"מ CaCl _2, 10mm דקסטרוז, pH 7.8) בתוך מעגל. המעגל הידרופובי עוזר לשמר את הזרע בינוני בתוך הגבול שלה.
2. העברת הזכרים 50-10 על המדיום הזרע.
3. הצגת שקופיות תחת מיקרוסקופ, להחזיק שני מזרקים מחוברים עם 27 מחטים מד על שתי הידיים.
4. השתמש באחת המחט "להחזיק" את התולעת ולהשתמש מחט אחרים לחתוך את הקצה האחורי של הזכרים לשחרר spermatids.
5. חיתוך התולעת בדרך כלל מגרש מספר עצום של spermatids מיידי. Spermatids נראים כמו דקה "גרגרי" תחת מיקרוסקופ הסטריאו. עם זאת, לפעמים חלק או רוב spermatids עשוי להישמר בתוך הפגר. במקרה כזה, בעדינות "גרירת" פגר על שקופיות הזכוכית עשויה להקל על שחרורו של spermatids מן השלד.
6. כדי להפעיל את spermatids, לנתח את התולעים בינוני זרע המכיל E 1X Pronase (20μg/ml) ולתת להם לשבת במשך 5 דקות.
7. אל תאפשר השקופיות להיות יבש בכל נקודת זמן הניסוי. הוסף בינוני זרע 1X יותר במידת הצורך.

4) ויזואליזציה של spermtids ו זרע

1. בעדינות למקום coverslip על פני השטח של מדגם גזור.
2. מצא את תחום spermatids בהגדלה נמוכה (10X)
3. הפרטים הקטנים של spermatids או זרע ניתן לראות על ידי מעבר ההגדלה גבוה יותר - בדרך כלל טבילה שמן 100x.

5) נציג תוצאות

דוגמה תמונה של DIC spermatids מבודד זכר C. elegans מוצג באיור 1. Spermatids הם כדוריים בצורת גרעינים בולטים. הופעל בשנת זרע במבחנה מוצגות באיור 2.

באיור 1. DIC תמונה של ג elegans spermatids.

איור 2. DIC תמונה של במבחנה מופעל C. elegans זרע.

Discussion

בנוסף לניתוח מוטנטים SPE, פרוטוקול זה יש יישומים חשובים אחרים, כגון ניתוח מורפולוגיה הזרע עם ההזדקנות. Spermatids ו זרע בודד בפרוטוקול זה יכול לשמש בניסויים במורד אחרים כגון, immunostaining מסוג בר זרע מוטנטי ^{8, 9,} תנועתיות הזרע על ¹⁰ שקופיות, מדידות פיזיולוגיות ^{9, 11,} או אפילו הזרעה מלאכותית ^12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tuberculin syringe	BD Biosciences	309623	Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in
Pap pen	Zymed Laboratories, Inc.	00-8888
VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides	VWR international	16004-406	Dimension: 75X25X1mm
Cover glass	VWR international	48366045
Protease	Sigma-Aldrich	P-6911