Summary
Erkeğin spermatid yalıtma ve etkinleştirmek için bir protokol
Abstract
Erkek ve çift cinsiyetli nematod C. elegans iki doğal olarak bulunan cinsel formları vardır. Amoeboid sperm, hem erkek ve hem de çift cinsiyetli tarafından üretilmektedir. Yaklaşık 300 - gametogenezis önceki aşamasında, çift cinsiyetli, germ hücreleri sperm sınırlı sayıda içine farklılaştırmak ve sperm kesesi olarak adlandırılan küçük bir 'çanta' saklanır. Daha sonra, sürekli oosit 1 çift cinsiyetli. Buna karşılık, erkekler onların yetişkinlik boyunca sadece sperm üretir. Erkekler, tipik bir yetişkin solucan 2 toplam hücrelerinin>% 50 hesapları bu kadar sperm üretir . Bu nedenle, erkekler sperm izole çift cinsiyetli, daha kolaydır.
Erkeklerde sadece küçük bir kısmını doğal X kromozomu 3 spontan olmayan disjunction nedeniyle oluşturulur. Daha rahat erkek veya mutasyonlar, O'na yol vermek için giriş (Erkekler Yüksek İnsidans) fenotip ile çift cinsiyetli Geçişi bir erkek nüfusun 3 zenginleştirmek hangi stratejilerin bazılarıdır.
Erkekler kuyruk morfolojisi 4 gözlemleyerek hermafroditlerde kolaylıkla ayırt edilebilir. Erkek kuyruk çiftleşme yapıları ile yuvarlak ise Hermafrodit kuyruğu, sivri.
Kesme kuyruk, erkek üreme sistemi içinde saklanan spermatid çok sayıda serbest bırakır. Diseksiyon bir stereo mikroskop altında 27 gauge iğne kullanılarak yapılır. Spermatid fiziksel herhangi bir diğer hücrelere bağlı olmadığından, hidrolik basınç spermatid 2 de dahil olmak üzere erkek vücudunun iç içeriği , ihraç etti.
Erkekler doğrudan 'Sperm Orta' küçük bir damla disseke edilir. Spermatid pH değişikliğe duyarlıdır. Bu nedenle, iyi bir tamponlama kapasitesine sahip bir bileşik HEPES sperm medyada kullanılmaktadır. Glikoz ve sperm medya bulunan diğer tuzlar osmotik basıncı korumak sperm bütünlüğünü korumak için yardımcı olur.
Spermatozoa içine spermatid Post-mayotik farklılaşma spermiogenesis veya sperm aktivasyon denir. 5 Titreşim ve Nelson 6 yuvarlak spermatid Burada C. in vitro spermiogenesis göstermek Pronase E. dahil olmak üzere çeşitli aktive bileşikleri ekleyerek sperm ayırt etmek için daha önce uyarılan olabileceğini gösterdi Pronase E. kullanarak elegans spermatid
Başarılı spermiogenesis doğurganlık için ön koşuldur spermiogenesis kusurlu mutantlar ve dolayısıyla sterildir. Şimdiye kadar birkaç mutantlar özellikle spermiogenesis süreci 7 kusurlu olduğu görülmüştür. Anormallik roman Bedelli (Spermatogenez kusurlu) in vitro aktivasyonu mutantlar bize, bu etkinliğe katılan ek oyuncular keşfetmenize yardımcı olacak sırasında bulundu .
Protocol
Erkek nüfusun 1) Zenginleştirme
- Deneysel ihtiyaç bağlı olarak, çok sayıda erkek, aşağıdaki stratejilerden birini kullanılarak elde edilebilir:
- vahşi tip erkeklerin büyük bir nüfus OP50 numaralı seribaşı NGM plaka merkezinde küçük bir çim 5 vahşi tip erkek ve 1 hermafrodit geçerek elde edilebilir. Sonraki nesil vahşi tip erkeklerin yaklaşık% 50 olacaktır.
- onu-5 (e1490) ya da onun-8 (e1489) çift cinsiyetli onu 5 erkek çok sayıda atmak ve onu 8 erkek verimli ve sperm morfolojisi ve fonksiyonu hiçbir belirgin bir bozukluk vardır . Yani, ona-5 ya da onun-8 erkek birçok deneyler için vahşi tip erkeklerin yerine kullanılabilir.
2 erkek) Tanımlama ve izolasyon
- Solucanlar kuyruk morfolojisi inceleyin; erkek solucan kuyruğu yuvarlanır.
- L4 aşamasında erkek Alış ve E. ile NGM plaka numaralı seribaşı aktarabilirsiniz coli onları bir veya iki gün büyümeye OP50 ve bırakın. Hermafroditlerde yokluğunda Büyüyen bekâr erkeklerin sperm kaybını önlemek ve böylece spermatid çok sayıda deneysel prosedür sırasında kullanılabilir olacaktır.
- Diseksiyon gününde, bakteri NGM plaka bekâr erkek aktarmak ve onları birkaç dakika için tarama izin. Bu adım, E. küçük bir katman giderilmesine yardımcı olur coli, solucanlar yüzey üzerine yapıştırılır . Alternatif olarak, pipet (6g Na 2 HPO 4, 3g KH 2 PO 4, 5g NaCl, 0.25g MgSO litre başına 4 .7 H 2 O) M9 tampon tampona bir saat cam ve transferi erkek küçük hacimli.
3 erkek ve in vitro aktivasyon) Diseksiyon
- Bir cam slayt atın ve pap kalem kullanarak küçük bir daire işareti. Pipet 1X Sperm Orta 30-50 ul daire içinde (50mm Hepes, 25mm KCl, 45mm NaCl, 1mm MgSO 4, 5mM CaCl 2, 10mM Dekstroz; pH 7.8). Hidrofobik daire, kendi sınırları içinde sperm ortamı korumak için yardımcı olur.
- 5-10 erkeklerde sperm orta aktarın.
- Mikroskop altında slayt görüntüleme, hem de ellerinizi 27 gauge iğne ile bağlanmış iki şırınga tutun.
- Solucan 'durdurma' ve spermatid serbest erkeklerde posterior ucu kesmek için başka bir iğne kullanınız bir iğne kullanın.
- Kesme solucan genellikle anında spermatid çok sayıda ihraç etti. Spermatid dakika stereo mikroskop altında 'granül olarak görünür. Ancak, bazen kısmen ya da spermatid en karkas içinde muhafaza edilebilir. Bu durumda, cam slayt üzerine hafifçe karkas 'sürükleyerek' karkas spermatid serbest bırakılması kolaylaştırabilir.
- Spermatid etkinleştirmek için, solucanlar Pronase E (20μg/ml) içeren 1X Sperm Orta incelemek ve bunları 5 dakika bekletin.
- Slayt, deney herhangi bir zaman noktasında kuru olmak için izin vermeyin. Gerekirse daha 1X Sperm Orta ekleyin.
4) spermtids ve sperm Görselleştirme
- Disseke numune yüzeyinde bir lamel yavaşça yerleştirin.
- Düşük büyütme (10X) altında spermatid alanında bul
- Genellikle 100X immersiyon yağı - spermatid veya sperm ince ayrıntıları yüksek büyütme hareket ettirerek gözlenen olabilir.
5) Temsilcisi Sonuçlar
Erkek C. elegans izole spermatid DIC görüntünün bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir. Spermatid şekli küresel ve çekirdekleri belirgindir. In vitro aktif sperm Şekil 2'de gösterilmiştir.
Şekil 1. C. DIC görüntü elegans spermatid.
Şekil 2 in vitro aktive C. DIC görüntü elegans spermatozoa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedelli mutantlar analiz ek olarak, bu protokol, yaşlanma ile sperm morfolojisi analiz gibi diğer önemli uygulamaları vardır. Spermatid ve spermatozoa izole bu protokolü kullanarak, yabani tip ve mutant sperm 8, 9, 10, fizyolojik ölçümler slaytlar 9, 11, hatta suni tohumlama 12 sperm motilite immün gibi diğer alt deneylerinde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz teşekkür ederiz Samuel Ward, Diane C. Bu teknikte öncü Titreşim ve Gregory Nelson. Biz aktif sperm gösteren videolar için teşekkür Pavan Kadandale ve Brian Geldziler yararlı tartışmalar için Singson laboratuar üyeleri; CGC suşları ve NIH hibe (R01HD054681) aracılığı ile bize destek için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tuberculin syringe | BD Biosciences | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
| Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides | VWR international | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
| Cover glass | VWR international | 48366045 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. , Vol. 48 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
