Summary
Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyses.
Abstract
Isolatie van immuuncellen die het centrale zenuwstelsel (CZS) tijdens infectie, trauma, auto-immuniteit of neurodegeneratie infiltreren, is het vaak nodig om hun fenotype en effector functies te definiëren. Histochemische benaderingen zijn wat belangrijk is voor de locatie van de infiltrerende cellen te bepalen en om de bijbehorende CNS pathologie analyseren. Echter, in-situ histochemie en immunofluorescentie kleuringstechnieken beperkt door het aantal antilichamen die gebruikt kunnen worden in een keer om immuun cel subtypen karakteriseren in een specifiek weefsel. Daarom, histologische benadering in combinatie met immuun-fenotypering door flowcytometrie zijn cruciaal voor het volledig karakteriseren van de samenstelling van de lokale CNS infiltratie. Dit protocol is gebaseerd op de scheiding van CNS cellulaire suspensies meer dan discontinous Percoll gradiënten. Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor de identificatie van verschillende immuun celpopulaties in een enkel monster door flowcytometrie.
Protocol
Bereiding van reagentia
Bereid voorraad isotone Percoll (SIP), 4 ml per hersenen, door het mengen van 9 delen van Percoll met een deel van de 10X HBSS zonder Ca + + en Mg + +.
Bereid SIP op 70% in 1X HBSS zonder Ca + + en Mg + +, 2 ml per hersenen gedispenseerd in een 15 ml polypropyleen conische buis.
Opmerking: Het is aanbevolen dat Percoll moet worden gebruikt bij kamertemperatuur, als het gebruikt wordt koud, de cellen hebben de neiging te klonteren en cel-scheiding is minder efficiënt.
Tissue verzamelen en homogenisering
Verdoven muizen en perfuseren door middel van de linker ventrikel met ijs-koud 1X HBSS. Ontleden hersenen en het ruggenmerg en in stand houden in RPMI zonder fenol rood tot alle muizen worden opgeofferd.
Plaats weefsels in 7 of 15 ml dounce homogenisator met 3 ml RPMI, voorzichtig een celsuspensie met een loose-fitting pestle (A maat), gevolgd door een Tigh-fitting pestle (B grootte) om verder te distantiëren van de weefsels. Vul het volume van de cel suspensies tot 7 ml met RPMI.
Gradient opgezet
Voeg 3 ml van SIP naar de celsuspensie tot een definitief 30% SIP maken
Langzaam laag van de 10 ml celsuspensie op de top van de 70% SIP. Dit is de meest kritische fase van de procedure, gebruik van een pipet-steun zijn vastgesteld in de zwaartekracht wijze het vermijden van vermenging van de 70% en 30% oplossingen. Een heel duidelijke vlakke lijn moet duidelijk zichtbaar zijn op de 70% -30% kruising.
Centrifugeer 30 min bij 500G 18 ° C. Zorg ervoor dat centrifuge stopt met minimale of geen rem, zodat de interfase niet wordt verstoord.
Met behulp van een overdracht pipet, verwijder voorzichtig de laag van puin uit de top van de buis en verzamel 2.0-3.0 ml van de 70% -30% interfase in een schone conische buis met 8 ml 1X HBSS. Zorg ervoor dat de Percoll met de interfase wordt verdund ongeveer drie keer, een paar keer meng door inversie en centrifugre 7 minuten bij 500G bij 18 ° C.
Resuspendeer pellet in 1 ml van cel verkleuring buffer en overbrengen naar een 1,5 ml buis en wassen nog een keer met behulp van een micro-centrifuge bij 10.000 G 1 min bij 4 ° C.
Antilichaam vlekken
Resuspendeer pellets in 50 ul van gezuiverde antimouse CD16/CD32 verdund 1:200 in cel verkleuring buffer aan het Fc-bindingsplaatsen te blokkeren. Incubeer met ijs gedurende 10 minuten. Tellen cellen met behulp van een hemocytometer.
Voeg 50 ul van antilichamen cocktail mix en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Elk antilichaam moet eerst worden getitreerd tot een optimale verdunning te beoordelen. Gebruik de juiste fluorochroom combinaties gekozen op basis van de mogelijkheden van laser-en filter-instellingen van uw specifieke flowcytometer.
Was de cellen in cel verkleuring buffer, opnieuw in suspensie pellets in 100-200 pi cel verkleuring buffer en analyseren onmiddellijk in de cytometer, of als alternatief cellen kunnen worden gesuspendeerd in 2% paraformaldehyde (PFA), opgesteld in PBS en opgeslagen over-nacht bij 4 ° C .
Representatieve resultaten:
Na het draaien van de hellingen, moet de 70% -30% interfase hebben een bepaalde witte halo, en kwantificering van de cellen hersteld van een naïeve muis moet opleveren 3-5 x10 5 cellen per muis (hersenen plus ruggenmerg). Ontstoken hersenen zou kunnen hebben, variërend aantallen van ontstekingscellen, afhankelijk van het CZS belediging of de ziekte model (figuur 1).
Figuur 1. Isolatie van mononucleaire cellen, van naïef en EAE-hersenbarrière tijdens piek-en vaatziekten. Hersencellen suspensies werden gescheiden dan discontinu 70% / 30% Percoll gradiënten. Cellen gekleurd werden geïncubeerd met Fc-blok, gevolgd door anti-CD45 antilichamen voor 30 min op ijs. Cellen werden gespoeld in cel verkleuring buffer, en gefixeerd in 2% PFA eerdere verwerving in een LSR-II. CD45 intensiteit wordt gemeten in de Y-as, waar drie verschillende populaties worden gevisualiseerd. Verdere karakterisering van het immuunsysteem fenotype van CD45 hi infiltrerende cellen wordt uitgevoerd met behulp van extra antilichamen en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyses van celoppervlaktemerkers in het CZS leukocyten uit normale muis ontstoken weefsels zijn gebruikt voor enkele decennia 1-3. Isolatie protocollen zijn gebaseerd op de scheiding van microglia en leukocyten door de dichtheid centrifugeren 4. Hier beschrijven we een snelle en effectieve methode voor het isoleren van CNS leukocyten met behulp van discontinue Percoll gradiënten. Na isolatie van cellen, kleuring met verschillende antilichamen, zoals-maar niet beperkt tot-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19, etc. maakt de identificatie van het immuunsysteem van de bevolking dat de CNS infiltreren bij de inductie van een bepaalde pathologie. Kleuring met anti-CD45 antilichamen toont drie verschillende populaties door flow cytometrie; (1) CD45 negatieve populatie die bestaat uit neuronale cellen, astrocyten en oligodendrocyten onder andere zenuwcellen, (2) CD45 lo of intermediair die meestal surveillant microgliacellen, (3) bevat CD45 hi bevolking bestaat uit infiltreren hematogene leukocyten. Het bestuderen van de bijdrage van myeloïde cellen tijdens de CNS pathologieën is uitdagend. Echter, de combinatie van de verschillende cellen oppervlakte markers 5, 6 en het gebruik van beenmerg chimere muizen aangetoond inzicht in de functionele verschillen van myeloïde cellen tijdens de CNS ontsteking 2, 7, 8. Na immunisatie met myeline-peptiden, is een auto-immuunreactie opgewekt en een massale toevloed van bloedcellen is aangetrokken om de hersenen. Na dit punt is er een breed repertoire van antilichamen beschikbaar om het fenotype van deze cellen, hetzij door de aanwezigheid van verschillende celoppervlak moleculen, maar ook als uitdrukking van intracellulaire eiwitten zoals cytokines of transcriptiefactoren te bestuderen.
Wanneer homogeniseren de weefsels, gebruik extreme voorzichtigheid hanteren van de homogenisator met gemak. Mononucleaire fagocyten zijn zeer gevoelig voor autolyse. Als ervaren klonteren van de cellen, de praktijk een zachtere homogenisering protocol en voeg DNase aan de buffer tijdens de homogenisering stap. Daarom beoordelen percentage van de cel dood in uw geïsoleerde populatie. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende enzymen, zoals collagenase, dispase onder andere toe te voegen. De opbrengst van de cellen is meestal hoger. Echter, sommige celoppervlaktemerkers zijn vatbaar voor deze behandeling en daarom zullen hun ontdekking te beperken door middel van flowcytometrie als gevolg van hun splitsing door proteasen. In ons protocol, routinematig we het gebruik van enzymen te voorkomen, te ontleden weefsels zo snel mogelijk, zonder afbreuk te doen aan de perfusie, en vermijd het verlaten van de weefsels voor lange tijd op het ijs (> 1 uur) voorafgaand homogeniseren. De beschreven protocol heeft de potentie om te worden toegepast op de genexpressie, eiwit-en celcultuur van de geïsoleerde bevolking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T naar AEC) en de Universiteit van Texas in San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
|
References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
