Summary
本文介绍一个快速的协议，有效地从大脑和脊髓组织，可以有效地利用流式细胞仪分析中分离出的单个核细胞。
Abstract
渗透在中枢神经系统感染，外伤，自身免疫性疾病或神经退行性疾病（CNS）的免疫细胞的分离，往往需要定义其表型和效应功能。组织化学方法有助于确定的浸润细胞的位置，并分析相关的中枢神经系统病理。然而，在原位组织化学及免疫荧光染色技术可以在一个单一的时间用来描述在一个特定的组织的免疫细胞亚型的抗体数量是有限的。因此，组织学与免疫表型流式细胞仪结合的方法是至关重要的，充分体现当地中枢神经系统浸润的组成。该协议是基于对中枢神经系统的细胞悬浮液比不连续percoll梯度分离。本文介绍一个快速的协议，有效地从大脑和脊髓组织，可以有效地利用各种免疫细胞群，在流式细胞仪检测单个样品的鉴定中分离出的单个核细胞。
Protocol
试剂的制备
准备与10X的HBSS部分没有搅拌约9 percoll部分股票等渗percoll（SIP），4毫升，每大脑+ +和Mg + +。
准备在70％1X的HBSS SIP的无钙+ +和Mg + +中，大脑每2毫升到15毫升的聚丙烯锥形管处方。
注：建议percoll应在室温下使用，如果使用的冷，细胞易于聚集和细胞分离效率较低。
组织收集和同质化
通过左心室与冰冷的1X的HBSS麻醉小鼠和灌注。解剖大脑和脊髓和保持无酚红的RPMI的牺牲，直到所有的老鼠。
7或15毫升dounce匀浆包含3毫升的RPMI组织，轻轻地用一个宽松的杵由tigh装修杵（B尺寸）进一步游离于组织（大小）一个细胞悬液。完成卷7毫升细胞悬液，用RPMI。
梯度设置了
加入3毫升的SIP细胞悬液，作最后的30％的SIP
慢慢层10 mL细胞悬液，70％的SIP上。这是最关键的一步程序，用吸管援助在重力作用下，避免混合70％和30％的解决方案的模式设置。一个非常明确的平线应在70％-30％的交界处可见。
在500G 18 ° C离心30分钟确保离心机将与很少或没有刹车停止，使相间不受影响。
使用吸管转移，轻轻取出碎片层，从管的顶部，并收集到一个干净的锥形管，含8毫升的1X的HBSS的2.0-3.0毫升的70％-30％相间。确保包含相间的percoll稀释约三倍，在500G混合几次反演和centrifugre 7分钟，在18 ° C。
悬浮颗粒细胞染色缓冲液1毫升，并将其转移到1.5 ml管和洗一个更多的时间使用一个微型离心机10,000 G 1分钟在4 ° C
抗体染色
在50μL的纯化antimouse CD16/CD32悬浮颗粒在细胞染色缓冲液稀释1:200块FC的结合位点。在冰上孵育10分钟。使用血球计数细胞。
添加50μL抗体鸡尾酒组合，并在冰上孵育30分钟。必须首先每个抗体滴定，以评估最佳稀释。请根据您的特定流式细胞仪激光和过滤器设置的功能选择合适的荧光组合。
在100-200细胞染色缓冲液洗细胞在细胞染色缓冲液，悬浮颗粒，并立即在流式细胞仪分析，或者细胞可悬浮在2％的多聚甲醛的PBS准备（PFA）和4存储通宵° C 。
代表性的成果：
旋转梯度后，应在70％-30％相间有一个定义的白色光晕，并从一个天真的鼠标恢复细胞的定量应产量3-5 X10 5％的小鼠细胞（脑部以及脊髓）。发炎的大脑可能有不等的炎性细胞的数目，取决于中枢神经系统的侮辱或疾病模型（图1）。
图1分离单个核细胞从幼稚和EAE的大脑，在繁忙的疾病。脑细胞悬浮液中分离比不连续的70％/ 30％percoll梯度。与FC块培养细胞染色，抗CD45抗体在冰上30分钟。细胞在细胞染色缓冲液冲洗，并固定在2％PFA在一个LSR - II之前收购。 CD45的强度测量Y轴，三个不同的人群，可视化。使用额外的抗体CD45 您好浸润细胞的免疫表型的进一步鉴定，后经流式细胞仪分析。
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Discussion
中枢神经系统的白细胞从正常和炎症鼠标组织中的细胞表面标记的分析已动用1-3几十年。隔离协议是基于在小胶质细胞和白细胞密度离心分离4。在这里，我们描述一个孤立的中枢神经系统的白细胞使用不连续percoll梯度的快速和有效的方法。经过细胞的分离，染色等各种抗体AS -的，但不局限于- CD45，CD4，CD8细胞CD11b，CD19等可以渗透后一个特定的病理诱导中枢神经系统的免疫人群的识别。抗CD45抗体染色流式细胞仪显示了三个不同的人群;（1）（2）CD45阴性人口组成的神经元细胞，星形胶质细胞和少突胶质细胞，神经细胞等等CD45 的 LO或中间，其中包含主要是监测小胶质细胞，（ 3） CD45 您好人口组成的血行白细胞浸润。贡献髓细胞在中枢神经系统的病理研究已具有挑战性。然而，结合各种细胞的表面标志物5，6和骨髓嵌合体小鼠的使用表明骨髓细胞在中枢神经系统炎症2，7，8的功能区别的见解。髓鞘肽的免疫接种后，免疫反应是诱导和血细胞的大量涌入，被招募到大脑。这一点后，有广泛的研究，通过各种细胞表面分子的存在，以及细胞内蛋白质，如细胞因子或转录因子的表达，这些细胞表型抗体剧目。
当均质的组织，使用极端谨慎处理均质轻松。单核吞噬细胞极易受到自溶。如果细胞的聚集，实行温和的同质化协议，并在同质化的步骤DNA酶添加到缓冲区。因此，评估在你孤立的人口死亡的细胞百分比。该协议可以很容易地修改，添加各种消化酶如胶原酶，dispase，等等。细胞的收益率通常较高。然而，一些细胞表面标志是容易受到这种待遇，因此会限制他们的检测，流式细胞仪，由于其蛋白酶裂解。我们经常在我们的协议，避免使用消化酶，尽可能快，不影响灌注解剖组织，并避免长时间留在冰（1小时）前的同质化的组织。该协议有可能被应用到基因表达，蛋白质和细胞的孤立人口文化。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国家多发性硬化症协会（TA 3021 - A1 /吨的AEC）和圣安东尼奥的得克萨斯大学的支持。
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
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References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
