Summary
Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour des analyses de cytométrie en flux.
Abstract
Isolement des cellules du système immunitaire qui infiltrent le système nerveux central (SNC) lors d'une infection, un traumatisme, une auto-immunité ou de la neurodégénérescence, est souvent nécessaire pour définir leur phénotype et les fonctions effectrices. Des approches histochimiques sont instrumentales pour déterminer l'emplacement des cellules infiltrant et d'analyser le système nerveux central pathologie associée. Cependant, in situ histochimie et techniques en immunofluorescence sont limitées par le nombre d'anticorps qui peuvent être utilisés à un moment unique pour caractériser les sous-types de cellules immunitaires dans un tissu particulier. Par conséquent, les approches histologiques en conjonction avec le système immunitaire de phénotypage en cytométrie en flux sont essentielles pour caractériser complètement la composition de l'infiltration du SNC locales. Ce protocole est basé sur la séparation des suspensions cellulaires du SNC au cours gradients de Percoll discontinu. Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour l'identification des différentes populations de cellules immunitaires dans un seul échantillon par cytométrie en flux.
Protocol
Préparation des réactifs
Préparez le bouillon isotonique Percoll (SIP), 4 ml par le cerveau, en mélangeant 9 volumes de Percoll avec une partie de HBSS 10X sans Ca + + et Mg + +.
Préparer SIP à 70% en 1X HBSS sans Ca + + et Mg + +, 2 ml par le cerveau dispensés dans un tube de 15 ml en polypropylène coniques.
Note: Il est recommandé que Percoll doit être utilisée à température ambiante, s'il est utilisé à froid, les cellules ont tendance à s'agglutiner et à la séparation des cellules est moins efficace.
Collection de tissus et d'homogénéisation
Anesthetize souris et perfuser à travers le ventricule gauche, avec glacée HBSS 1X. Disséquer le cerveau et la moelle épinière et de maintenir en RPMI sans rouge de phénol jusqu'à ce que toutes les souris sont sacrifiées.
Placer les tissus en 7 ou 15 ml Dounce homogénéisateur contenant 3 ml de RPMI, doucement prendre une suspension de cellules avec un pilon lâches (Une taille) suivie par un pilon Tigh-montage (taille B) de continuer à dissocier les tissus. Compléter le volume de la suspension cellulaire à 7 ml avec du RPMI.
Dégradé mis en place
Ajouter 3 ml de SIP à la suspension cellulaire pour faire un SIP finale de 30%
Lentement couche de la suspension cellulaire 10 ml au sommet de la SIP à 70%. C'est l'étape la plus critique de la procédure, utiliser une pipette de secours mis en mode gravité en évitant le mélange des 70% et 30% des solutions. Une ligne très claire plate devraient être visibles à la jonction de -30% à 70%.
Centrifuger 30 min à 18 ° C. 500G Assurez-vous centrifugeuse s'arrête avec frein peu ou pas de telle sorte que l'interphase n'est pas perturbé.
En utilisant une pipette de transfert, retirer délicatement la couche de débris provenant du haut du tube de 2,0 à 3,0 ml et recueillir de l'interphase 70% -30% dans un tube propre coniques contenant 8 ml de 1X HBSS. S'assurer que le Percoll contenant de l'interphase est dilué environ trois fois, mélanger à quelques reprises par inversion et centrifugre 7 min à 500G à 18 ° C.
Resuspendre le culot dans 1 ml de tampon de coloration des cellules et le transférer dans un tube de 1,5 ml et laver une fois de plus l'aide d'une micro-centrifugeuse à 10.000 G 1 min à 4 ° C.
Coloration des anticorps
Granulés Remettre en suspension dans 50 pl de purifier antisouris CD16/CD32 dilué 1:200 dans un tampon de coloration des cellules pour bloquer les sites Fc contraignant. Incuber sur la glace pendant 10 min. Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
Ajouter 50 ul de mélange de cocktail d'anticorps et incuber sur de la glace pendant 30 min. Chaque anticorps doit d'abord être titré pour évaluer la dilution optimale. Utiliser les combinaisons fluorochrome choisi selon les capacités du laser et des paramètres de filtre de votre cytomètre en flux particulier.
Laver les cellules dans un tampon de coloration des cellules, des pastilles resuspendre dans 100-200 ul de tampon de coloration des cellules et d'analyser immédiatement dans le cytomètre, ou bien les cellules peuvent être remises en suspension dans 2% de paraformaldéhyde (PFA) préparée dans du PBS et stockées pendant une nuit à 4 ° C .
Les résultats représentatifs:
Après filer les gradients, l'interphase 70% -30% devrait avoir un halo blanc défini, et la quantification des cellules récupérées à partir d'une souris naïve devrait donner 3-5 x10 5 cellules par souris (cerveau, plus de la moelle épinière). Enflammé du cerveau pourrait avoir un nombre allant de cellules inflammatoires en fonction de l'insulte du SNC ou modèle de la maladie (figure 1).
Figure 1. Isolement de cellules mononucléées, de naïf et EAE-cerveau à la maladie de pointe. Les cellules du cerveau suspensions ont été séparés plus discontinue de 70% / 30% des gradients de Percoll. Tachés cellules ont été incubées avec Fc-block suivi par des anticorps anti-CD45 pendant 30 min sur la glace. Les cellules ont été rincées dans un tampon de coloration des cellules, et fixé dans l'acquisition de PFA 2% avant dans un LSR-II. CD45 intensité est mesurée dans l'axe Y, où trois populations distinctes sont visualisés. Une caractérisation plus poussée du phénotype immunitaire des cellules CD45 Salut infiltrant est implémenté en utilisant des anticorps supplémentaires et ensuite analysés par cytométrie en flux.
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Discussion
Les analyses des marqueurs de surface cellulaire dans les leucocytes dans les tissus du système nerveux central de souris normales et enflammée a été utilisé pendant plusieurs décennies 1-3. Protocoles d'isolement sont basés dans la séparation de la microglie et des leucocytes par centrifugation 4 densité. Nous décrivons ici une méthode rapide et efficace d'isoler les leucocytes SNC utilisant gradients de Percoll discontinu. Après isolement des cellules, la coloration avec des anticorps tels que, mais non limité à-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19, etc permet l'identification des populations immunitaires qui infiltrent le système nerveux central lors de l'induction d'une pathologie particulière. La coloration avec des anticorps anti-CD45 révèle trois populations distinctes par cytométrie en flux; (1) de la population CD45 négative constituée de cellules neuronales, les astrocytes et des oligodendrocytes, entre autres les cellules nerveuses, (2) CD45 lo ou intermédiaire qui contient surtout surveillant les cellules microgliales, (3) CD45 population Salut composée d'infiltrer les leucocytes hématogène. Etudier la contribution des cellules myéloïdes au cours des pathologies du système nerveux central a été difficile. Cependant, la combinaison de différents marqueurs de surface des cellules 5, 6 et l'utilisation de souris chimériques moelle osseuse ont montré un aperçu de la distinction fonctionnelle des cellules myéloïdes lors d'une inflammation du SNC 2, 7, 8. Après la vaccination avec des peptides de la myéline, une réaction auto-immune est induite et un afflux massif de cellules sanguines est recruté pour le cerveau. Après ce point, il ya un large répertoire d'anticorps disponibles pour étudier le phénotype de ces cellules, soit par la présence de diverses molécules de surface cellulaire, ainsi que l'expression de protéines intracellulaires tels que les cytokines ou les facteurs de transcription.
Lorsque l'homogénéisation des tissus, avec une extrême prudence la manipulation de l'homogénéisateur avec facilité. Les phagocytes mononucléaires sont très sensibles à l'autolyse. Si l'expérience agglutination des cellules, la pratique d'un protocole plus doux et ajouter la DNase homogénéisation à la mémoire tampon lors de l'étape d'homogénéisation. Par conséquent, d'évaluer le pourcentage de cellules mortes dans votre population isolée. Ce protocole peut être facilement modifié pour y ajouter diverses enzymes digérant, telles que la collagénase, dispase entre autres. Le rendement des cellules est généralement plus élevé. Cependant, certains marqueurs de surface cellulaire sont sensibles à ce traitement et ne seront donc limiter leur détection par cytométrie en flux à cause de leur clivage par les protéases. Dans notre protocole, nous avons l'habitude d'éviter l'utilisation d'enzymes digérant, disséquer les tissus aussi rapide que possible sans compromettre la perfusion, et éviter de laisser les tissus pour de longues périodes de temps sur la glace (> 1h) homogénéisation préalable. Le protocole décrit a le potentiel pour être appliqué à l'expression des gènes, de protéines et de culture de cellules de la population isolée.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Multiple Sclerosis Society (AT 3021-A1 / T pour AEC) et l'Université du Texas à San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
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References
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