Summary
Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für den durchflusszytometrischen Analysen genutzt werden können.
Abstract
Isolierung von Immunzellen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) während der Infektion, Trauma, Autoimmunität oder Neurodegeneration zu infiltrieren, ist oft erforderlich, um ihren Phänotyp und Effektor-Funktionen zu definieren. Histochemische Ansätze sind instrumental, um die Lage der infiltrierenden Zellen zu bestimmen und die damit verbundenen ZNS-Pathologie zu analysieren. Allerdings sind in-situ Histochemie und Immunfluoreszenzfärbung Techniken durch die Anzahl der Antikörper, die zu einem einzigen Zeitpunkt genutzt werden, um Immunzellen Subtypen in einem bestimmten Gewebe zu charakterisieren können, beschränkt. Daher sind histologische Ansätze in Verbindung mit Immun-Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie kritischen vollständig zu charakterisieren die Zusammensetzung der lokalen ZNS Infiltration. Dieses Protokoll basiert auf der Trennung von ZNS-Zellsuspensionen über diskontinuierliche Percoll Gradienten basiert. Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für die Identifizierung von verschiedenen Immunzellen Populationen in einer einzigen Probe mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann.
Protocol
Vorbereitung der Reagenzien
Bereiten Lager isotonischen Percoll (SIP), 4 ml pro Gehirn, indem man 9 Teile Percoll mit einem Teil 10X HBSS ohne Ca + + und Mg + +.
Bereiten Sie SIP bei 70% in 1X HBSS ohne Ca + + und Mg + +, 2 ml pro Kopf in einen 15 ml-Polypropylen-konischen Rohr verzichtet.
Hinweis: Es wird empfohlen, Percoll bei Raumtemperatur verwendet werden sollte, falls verwendet Kälte, neigen Zellen zu verklumpen und Zellseparation ist weniger effizient.
Tissue-Sammlung und Homogenisierung
Anesthetize Mäusen und perfuse durch den linken Ventrikel mit eiskaltem 1X HBSS. Dissect Gehirn und Rückenmark und zu pflegen in RPMI ohne Phenolrot, bis alle Mäuse getötet werden.
Legen Gewebe in 7 oder 15 ml Dounce Homogenisator mit 3 ml RPMI sanft eine Zellsuspension mit einer locker sitzenden Pistill (A-Größe) durch eine Oberschenkel-Montage Stößel (B Größe) zur weiteren distanzieren Gewebe gefolgt. Füllen Sie das Volumen des Zell-Suspensionen zu 7 ml mit RPMI.
Gradient einrichten
3 ml SIP zu der Zellsuspension zu einer endgültigen 30% SIP machen
Langsam Schicht der 10 mL Zellsuspension auf dem 70% SIP. Dies ist der wichtigste Schritt des Verfahrens, Verwendung einer Pipette-Hilfe in der Schwere-Modus zu vermeiden Mischen von 70% und 30%-Lösungen gesetzt. Eine sehr klare flache Linie sichtbar sein soll an die 70% -30%-Übergang.
Zentrifuge 30 min bei 500G 18 ° C. Stellen Sie sicher, Zentrifuge wird mit minimalen oder keinen Bremse zu stoppen, so dass die Interphase nicht gestört wird.
Mit einem Transfer-Pipette vorsichtig ab, die Schicht der Ablagerungen aus dem oberen Ende des Röhrchens sammeln und 2,0-3,0 ml der 70% -30% der Interphase in ein sauberes konisches Rohr mit 8 ml 1X HBSS. Stellen Sie sicher, dass die Percoll mit der Interphase etwa das Dreifache verdünnt wird, mischen ein paar Mal durch Umdrehen und centrifugre 7 min bei 500G bei 18 ° C.
Pellet in 1 ml der Zell-Färbepuffer und überträgt es auf eine 1,5 ml-Tube und waschen ein weiteres Mal mit einem Mikro-Zentrifuge bei 10.000 G 1 min bei 4 ° C.
Antikörper-Färbung
Resuspendieren Pellets in 50 ul des gereinigten anti-Maus CD16/CD32 verdünnt 1:200 in Zelle Färbepuffer an den Fc-Bindungsstellen zu blockieren. Inkubieren auf Eis für 10 min. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
Add 50 ul Antikörper-Cocktail-Mix und Inkubation auf Eis für 30 min. Jeder Antikörper zunächst titriert werden, um eine optimale Verdünnung zu beurteilen. Verwenden Sie geeignete Fluorochrom Kombinationen ausgewählt nach den Möglichkeiten der Laser-und Filter-Einstellungen Ihres jeweiligen Durchflusszytometer.
Wash-Zellen in Zellen Färbepuffer, resuspendieren Pellets in 100-200 ul der Zelle Färbepuffer und analysieren sofort im Durchflusszytometer oder alternativ Zellen können in 2% Paraformaldehyd (PFA) in PBS resuspendiert vorbereitet und gespeichert werden über Nacht bei 4 ° C .
Repräsentative Ergebnisse:
Nach dem Spinnen der Gradienten, sollte die 70% -30% der Interphase haben einen definierten weißen Heiligenschein, und die Quantifizierung der Zellen aus einer naiven Maus erholt sollte 3-5 x10 5 Zellen pro Maus (Gehirn und Rückenmark) zu ergeben. Entzündete Gehirn haben könnte reichen Zahl der Entzündungszellen in Abhängigkeit von der ZNS-Beleidigung oder Krankheit Modell (Abbildung 1).
Abbildung 1. Isolierung von mononukleären Zellen aus naiven und EAE-Hirn-zu Spitzenzeiten Krankheit. Gehirnzellen Suspensionen wurden über diskontinuierliche 70% / 30% Percoll Gradienten getrennt. Zellen gefärbt wurden mit Fc-Block inkubiert, gefolgt von anti-CD45-Antikörper für 30 min auf Eis. Die Zellen wurden in Zellfärbung Puffer gespült und fest in 2% PFA vor Übernahme in ein LSR-II. CD45 Intensität ist in der Y-Achse, wo drei unterschiedliche Populationen visualisiert werden gemessen. Die weitere Charakterisierung der Immunabwehr Phänotyp CD45 hallo infiltrierenden Zellen erfolgt über zusätzliche Antikörper und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert.
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Discussion
Analysen von Zelloberflächenmarker in CNS Leukozyten aus normalen und entzündeten Mausgeweben seit mehreren Jahrzehnten 1-3 verwendet worden. Isolation Protokolle sind in der Trennung von Mikroglia und Leukozyten durch Dichtezentrifugation 4. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive Methode zur Isolierung von CNS Leukozyten mit diskontinuierlichen Percoll-Gradienten. Nach der Isolierung von Zellen, Färbung mit verschiedenen Antikörpern wie, aber nicht beschränkt auf-CD45 ermöglicht CD4, CD8, CD11b, CD19, etc. die Identifizierung von Immun-Populationen, die das ZNS bei Induktion einer bestimmten Pathologie zu infiltrieren. Die Färbung mit anti-CD45 Antikörper zeigt drei unterschiedliche Populationen mittels Durchflusszytometrie, (1) CD45 negativen Bevölkerung, bestehend aus Nervenzellen, Astrozyten und Oligodendrozyten ua Nervenzellen, (2) CD45 lo oder Zwischenprodukte, die meist surveillant Mikroglia-Zellen, (3) enthält CD45 hallo Bevölkerung, bestehend aus infiltrierenden hämatogene Leukozyten. Studium der Beitrag der myeloischen Zellen während der ZNS-Erkrankungen war eine echte Herausforderung. Allerdings haben die Kombination von verschiedenen Zellen Oberflächenmarker 5, 6 und die Verwendung von Knochenmark chimäre Mäuse Einblicke in die funktionelle Unterschiede der myeloischen Zellen während der Entzündung des ZNS 2, 7, 8 dargestellt. Nach Immunisierung mit Myelin-Peptide, ist eine Autoimmun-Reaktion induziert und einen massiven Zustrom von Blutzellen an das Gehirn rekrutiert. Nach diesem Punkt gibt es ein breites Repertoire von Antikörpern zur Verfügung, den Phänotyp dieser Zellen entweder durch das Vorhandensein verschiedener Zelloberflächenmoleküle, als auch die Expression von intrazellulären Proteinen wie Zytokinen oder Transkriptionsfaktoren zu untersuchen.
Wenn die Homogenisierung der Gewebe, extreme Vorsicht walten, Umgang mit dem Homogenisator mit Leichtigkeit. Mononukleäre Phagozyten sind sehr anfällig für Autolyse. Wenn erleben Verklumpung der Zellen, die Praxis eine sanftere Homogenisierung Protokoll und fügen DNase in den Puffer während der Homogenisierung Schritt. Deshalb bewerten Prozentsatz der Zelle tot in Ihrem isolierte Population. Dieses Protokoll kann leicht modifiziert werden, um verschiedene Enzyme, wie beispielsweise Collagenase, Dispase ua hinzuzufügen. Die Ausbeute an Zellen ist in der Regel höher. Doch einige Zelloberflächenmarker sind anfällig für diese Behandlung und werden daher ihre Detektion mittels Durchflusszytometrie durch ihre Spaltung durch Proteasen zu begrenzen. In unserem Protokoll, wir routinemäßig vermeiden den Einsatz von Enzymen, sezieren Gewebe so schnell wie möglich, ohne die Durchblutung und verhindern, dass das Gewebe für längere Zeit auf Eis (> 1 Stunde) vor der Homogenisierung. Das Protokoll beschrieben hat das Potenzial, die Genexpression, Protein-und Zell-Kultur des isolierten Population angewendet werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T, um AEC) und der University of Texas at San Antonio unterstützt.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
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References
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