Summary
El presente artículo describe un protocolo rápido para aislar eficazmente células mononucleares de tejidos de la médula espinal y el cerebro que puede ser efectivamente utilizado para el análisis de citometría de flujo.
Abstract
El aislamiento de las células inmunes que se infiltran en el sistema nervioso central (SNC) durante la infección, traumatismo, enfermedades autoinmunes o la neurodegeneración, es a menudo necesaria para definir su fenotipo y funciones efectoras. Métodos histoquímicos son fundamentales para determinar la ubicación de la infiltración de las células y para analizar el sistema nervioso central patología asociada. Sin embargo, in-situ histoquímica y técnicas de inmunofluorescencia tinción se ven limitados por el número de anticuerpos que se pueden utilizar en un momento único para caracterizar los subtipos de células inmunes en un determinado tejido. Por lo tanto, los enfoques histológicos en relación con el fenotipo inmunológico por citometría de flujo son fundamentales para caracterizar la composición de la infiltración del SNC local. Este protocolo se basa en la separación de suspensiones celulares del SNC más discontinuo gradientes de Percoll. El presente artículo describe un protocolo rápido para aislar eficazmente células mononucleares de tejidos de la médula espinal y el cerebro que puede ser efectivamente utilizada para la identificación de las diferentes poblaciones de células inmunes en una sola muestra por citometría de flujo.
Protocol
Preparación de los reactivos
Preparar acciones isotónica Percoll (SIP), 4 ml por el cerebro, mediante la mezcla de 9 partes de Percoll con una parte de HBSS 10 veces sin Ca + + y Mg + +.
Prepare SIP en un 70% en 1X HBSS sin Ca + + y Mg + +, 2 ml por cada cerebro se distribuye en un tubo de polipropileno cónico de 15 ml.
Nota: Se recomienda que Percoll se debe utilizar a temperatura ambiente, si se utiliza en frío, las células tienden a agruparse y separación celular es menos eficaz.
Tejido de recogida y homogeneización
Anestesiar a los ratones y perfundir a través del ventrículo izquierdo con helado de HBSS 1X. Diseccionar el cerebro y la médula espinal y mantener en RPMI sin rojo fenol hasta que todos los ratones son sacrificados.
Tejidos a cabo en 7 o 15 ml Dounce homogeneizadora que contiene 3 ml de RPMI, con cuidado hacer una suspensión de células con una mano suelta (un tamaño), seguido de un mortero de Tigh-instalación (tamaño B) a disociar aún más los tejidos. Completa el volumen de las suspensiones celulares a 7 ml con RPMI.
Gradiente de establecer
Añadir 3 ml de la SIP a la suspensión celular para hacer un último sorbo del 30%
Poco a poco la capa de la suspensión de células de 10 ml en la parte superior de la SIP el 70%. Este es el paso más crítico del procedimiento, utilice una pipeta de ayuda establecidos en el modo de evitar la mezcla de gravedad el 70% y 30% de las soluciones. Una línea plana muy claro debe ser visible en el cruce de 70% -30%.
Centrifugar 30 minutos a 500G 18 ° C. Asegúrese de centrífuga se detiene con un mínimo o ningún freno para que la interfase no se altera.
Usando una pipeta, retire suavemente la capa de escombros de la parte superior del tubo y recoger 2,0-3,0 ml de la interfase 70% -30% en un tubo limpio cónico que contiene 8 ml de 1X HBSS. Asegúrese de que el Percoll que contiene la interfase se diluye alrededor de tres veces, mezcla un par de veces por inversión y centrifugre min 7 de 500G a 18 ° C.
Resuspender el pellet en 1 ml de tampón de tinción celular y transferirlo a un tubo de 1.5 ml y lavar una vez más utilizando una centrifugadora micro-a 10.000 G 1 min a 4 ° C.
Tinción de anticuerpos
Pellets Resuspender en 50 l de agua purificada anti-ratón CD16/CD32 diluido 1:200 en buffer de tinción celular para bloquear los sitios de unión Fc. Incubar en hielo durante 10 min. Recuento de células utilizando un hemocitómetro.
Añadir 50 l de mezcla de anticuerpos cócteles e incubar en hielo durante 30 minutos. Cada anticuerpo debe ser el primero titulado para evaluar la dilución óptima. Uso adecuado de las combinaciones de fluorocromos elegidos en función de las capacidades del láser y la configuración de los filtros de su citómetro de flujo particular.
Lavar las células en un tampón de tinción de células, pellets de volver a suspender en 100-200 l de buffer de tinción celular y de analizar de inmediato en el citómetro, o, alternativamente, las células pueden ser resuspendidas en el 2% de paraformaldehído (PFA), preparado en PBS y se almacenan durante la noche a 4 ° C .
Los resultados representativos:
Después de girar los gradientes, el 70% -30% de la interfase debe tener definido un halo blanco, y la cuantificación de las células se recuperó de un ratón ingenuo debe producir 5.3 x 10 5 células por ratón (cerebro, además de la médula espinal). Cerebro inflamado podría tener que van del número de células inflamatorias en función de la lesión del SNC o modelo de la enfermedad (Figura 1).
Figura 1. Aislamiento de células mononucleares, de ingenuo y EAE-cerebro en la enfermedad de pico. Las células del cerebro suspensiones fueron separadas en discontinuo 70% / 30% de los gradientes de Percoll. Manchadas las células fueron incubadas con el FC bloque seguido por anticuerpos anti-CD45 durante 30 minutos sobre el hielo. Las células fueron lavadas en buffer de tinción de células, y se fija en el 2% antes de la adquisición de PFA en un LSR-II. CD45 intensidad se mide en el eje Y, en tres poblaciones distintas se visualizan. Además de la caracterización del fenotipo inmunológico de las células CD45 de alta infiltración se implementa el uso de anticuerpos adicionales y, posteriormente, analizadas por citometría de flujo.
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Discussion
Los análisis de marcadores de superficie celular en los leucocitos del SNC de los tejidos normales de ratón y se inflama se ha utilizado por décadas varios 1.3. Protocolos de aislamiento se basan en la separación de la microglía y leucocitos por cuatro densidad de centrifugación. Aquí se describe un método rápido y eficaz de aislar a los leucocitos del SNC con gradientes de Percoll discontinua. Después del aislamiento de las células, tinción con anticuerpos diferentes, tales como, pero no se limitan a-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19, etc permite la identificación de las poblaciones inmunes que se infiltran en el sistema nervioso central en la inducción de una patología en particular. La tinción con anticuerpos anti-CD45 muestra tres poblaciones distintas, por citometría de flujo; (1) CD45 negativas de la población que consta de células neuronales, astrocitos y oligodendrocitos entre las células nerviosas a otros, (2) CD45 he aquí o intermedio, que contiene células de la microglía en su mayoría surveillant, (3) CD45 de alta población que consiste en la infiltración de leucocitos hematógena. Estudiar la contribución de las células mieloides en patologías del SNC ha sido un desafío. Sin embargo, la combinación de varios marcadores de superficie de las células 5, 6 y el uso de ratones quiméricos de médula ósea han mostrado puntos de vista en las distinciones funcionales de las células mieloides en la inflamación del SNC 2, 7, 8. Tras la inmunización con péptidos de mielina, una reacción autoinmune es inducida y una afluencia masiva de células de la sangre es reclutado para el cerebro. Después de este punto, hay un amplio repertorio de anticuerpos disponibles para estudiar el fenotipo de estas células, ya sea por la presencia de diversas moléculas de la superficie celular, así como la expresión de las proteínas intracelulares como las citoquinas o factores de transcripción.
Cuando homogeneizar los tejidos, extreme las precauciones de manejo del homogeneizador con facilidad. Fagocitos mononucleares son altamente susceptibles a la autolisis. Si experimenta aglutinación de las células, la práctica de un protocolo de homogeneización suave y añadir DNasa en el búfer durante la etapa de homogeneización. Por lo tanto, evaluar el porcentaje de células muertas en la población aislada. Este protocolo se puede modificar fácilmente para añadir varias enzimas digestivas, tales como la colagenasa, dispasa entre otros. El rendimiento de las células es generalmente más alto. Sin embargo, algunos marcadores de superficie celular son susceptibles de este tratamiento y por lo tanto, limitar su detección por citometría de flujo, debido a su corte por proteasas. En nuestro protocolo, de manera rutinaria evitar el uso de enzimas para digerir, analizar los tejidos lo más rápido posible sin comprometer la perfusión, y evitar que los tejidos durante largos períodos de tiempo en el hielo (> 1 hora) antes de la homogeneización. El protocolo descrito tiene el potencial de ser aplicado a la cultura la expresión de genes, proteínas y células de la población aislada.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T para AEC) y la Universidad de Texas en San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
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References
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