Summary
Den aktuella artikeln beskrivs en snabb protokoll för att effektivt isolera mononukleära celler från hjärnan och ryggmärgen vävnader som kan utnyttjas effektivt för flödescytometrisk analyser.
Abstract
Isolering av immunceller som infiltrerar det centrala nervsystemet (CNS) vid infektion, trauma, autoimmunitet eller neurodegeneration, krävs ofta för att definiera deras fenotyp och effektorfunktioner. Histokemiska metoder bidrar till att bestämma platsen för infiltrera celler och för att analysera samband CNS patologi. Men in-situ histokemi och immunofluorescens tekniker färgning begränsad av antalet antikroppar som kan användas vid ett enskilt tillfälle att karaktärisera immunceller subtyper i en viss vävnad. Därför histologiska metoder i samband med immun-fenotypning med flödescytometri är kritiska till fullo karakterisera sammansättningen av lokala CNS-infiltration. Detta protokoll är baserad på separation av CNS cellulära suspensioner över diskontinuerlig Percoll gradienter. Den aktuella artikeln beskrivs en snabb protokoll för att effektivt isolera mononukleära celler från hjärnan och ryggmärgen vävnader som kan utnyttjas effektivt för identifiering av olika immunceller populationer i ett enda prov med flödescytometri.
Protocol
Beredning av reagenser
Förbered lager isoton Percoll (SIP), 4 ml per hjärnan, genom att blanda 9 delar Percoll med en del 10X HBSS utan Ca + + och Mg + +.
Förbered SIP på 70% i 1X HBSS utan Ca + + och Mg + +, 2 ml per hjärnan dispenseras i en 15 ml polypropylen koniska rör.
Observera: Det rekommenderas att Percoll bör användas vid rumstemperatur, om den används kall, celler tenderar att klumpa och cellseparation är mindre effektiv.
Tissue insamling och homogenisering
Bedöva möss och BEGJUTA genom vänster kammare med iskalla 1X HBSS. Dissekera hjärnan och ryggmärgen och upprätthålla i RPMI utan fenolrött tills alla möss offras.
Placera vävnader i 7 eller 15 ml dounce homogeniseringsblandare innehållande 3 ml RPMI försiktigt göra en cellsuspension med en löst sittande mortelstöt (A storlek) följt av en Tigh åtsittande mortelstöt (B storlek) för att ytterligare skilja vävnader. Fyll i volym cellsuspensioner till 7 ml med RPMI.
Gradient upprätta
Tillsätt 3 ml SIP till cellsuspension att göra en slutlig 30% SIP
Sakta lager 10 ml cellsuspension på toppen av 70% SIP. Detta är det mest kritiska steget i förfarandet, använd en pipett-stöd på allvar läge att undvika blandning av 70% och 30% lösningar. En mycket tydlig rak linje skall vara synliga vid 70% -30% korsning.
Centrifugera 30 min vid 500G 18 ° C. Se centrifug kommer att sluta med minimal eller ingen broms, så att faserna inte störs.
Med hjälp av en pipett försiktigt bort det lager av skräp från toppen av röret och samla 2,0-3,0 ml av 70% -30% interfas till ett rent koniskt rör som innehåller 8 ml 1X HBSS. Se till att Percoll innehåller faserna späds ungefär tre gånger, blanda några gånger genom inversion och centrifugre 7 min på 500G vid 18 ° C.
Resuspendera pelleten i 1 ml cellfärgning buffert och överföra det till ett 1,5 ml rör och tvätta en gång med hjälp av en mikro-centrifug vid 10000 G 1 min vid 4 ° C.
Antikropp färgning
Resuspendera pellets i 50 l renat antimouse CD16/CD32 späds 1:200 i cell färgning buffert för att blockera Fc-bindningsställen. Inkubera över is i 10 min. Räkna celler med en hemocytometer.
Tillsätt 50 l av antikroppar cocktail mix och inkubera på is i 30 min. Varje antikropp måste först titreras för att bedöma optimal utspädning. Använd lämplig fluorokrom kombinationer väljs enligt funktionerna i laser och filterinställningar i din flödescytometer.
Tvätta cellerna i cell färgning buffert, återsuspendera pellets i 100-200 ìl cellfärgning buffert och analysera direkt i cytometern, alternativt celler kan resuspenderas i 2% paraformaldehyd (PFA) upprättats i PBS och lagras över natten vid 4 ° C .
Representativa resultat:
Efter att snurra på lutningar, bör 70% -30% interfas har en definierad vit gloria, och kvantifiering av cellerna återhämtat sig från en naiv mus ska ge 3-5 x10 5 celler per mus (hjärnan plus ryggmärgen). Inflammerade hjärnan kanske har allt fler inflammatoriska celler beroende av CNS förolämpning eller sjukdom modell (figur 1).
Figur 1. Isolering av mononukleära celler, från naiv och EAE-hjärnan på topp sjukdom. Hjärnceller suspensioner skildes över diskontinuerlig 70% / 30% Percoll gradienter. Celler färgade inkuberades med FC-block följt av anti-CD45 antikroppar i 30 min på is. Celler sköljas i cellfärgning buffert, och som fastställs i 2% PFA tidigare förvärvet i en LSR-II. CD45 intensitet mäts i Y-axeln, där tre skilda populationer visualiseras. Ytterligare karakterisering av immunförsvaret fenotyp av CD45 hej infiltrera celler implementeras med hjälp av ytterligare antikroppar och därefter analyseras med flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyser av markörer på cellytan i CNS leukocyter från normalt och inflammerad mus vävnader har använts i flera decennier 1-3. Isolering protokoll är baserade i separation av mikroglia och leukocyter med densitet centrifugering 4. Här beskriver vi en snabb och effektiv metod för att isolera CNS leukocyter diskontinuerliga Percoll gradienter. Efter isolering av celler, färgning med olika antikroppar, såsom-men inte begränsat till-CD45, tillåter CD4, CD8, CD11b, CD19, etc. identifiering av immuna populationer som infiltrerar i CNS vid induktion av en viss patologi. Färgning med anti-CD45 antikroppar avslöjar tre skilda populationer med flödescytometri, (1) CD45 negativ befolkningsutveckling som består av nervceller, astrocyter och oligodendrocyter bland andra nervceller, (2) CD45 lo eller mellanliggande som innehåller mest surveillant mikrogliacellerna, (3) CD45 hej population bestående av infiltrera hematogen leukocyter. Studera bidrag myeloida celler under CNS-sjukdomar har varit utmanande. Har dock en kombination av olika celler ytan markörer 5, 6 och användningen av benmärgen chimär möss visat insikt i funktionell åtskillnad av myeloida celler under CNS inflammation 2, 7, 8. Vid immunisering med myelin peptider, är en autoimmun reaktion framkallas och en massiv tillströmning av blodkroppar är rekryteras till hjärnan. Efter denna punkt finns det en bred repertoar av antikroppar som finns att studera fenotypen av dessa celler, antingen genom närvaro av olika molekyler på cellens yta, samt uttryck av intracellulära proteiner såsom cytokiner eller faktorer transkription.
När homogeniserande vävnaderna, extremt försiktig hantering av homogeniseringsblandare med lätthet. Mononukleära fagocyter är mycket mottagliga för autolys. Om du får klumpar av celler, öva en mjukare homogenisering protokoll och lägga DNas till bufferten under homogenisering steg. Därför bedömer procent av cell död i din isolerade befolkningen. Detta protokoll kan enkelt ändras för att lägga till olika enzymer, som kollagenas, dispase bland annat. Avkastningen av celler ofta är högre. Men vissa cellytan markörer är mottagliga för denna behandling och kommer därför att begränsa sin upptäckt av flödescytometri på grund av sin klyvning av proteaser. I vårt protokoll, vi rutinmässigt undvika användning av enzymer, dissekera vävnad så snabbt som möjligt utan att äventyra perfusion, och undvik att lämna vävnader under lång tid på is (> 1 timme) före homogenisering. Protokollet beskrivs har potential att tillämpas på genuttryck, protein och cellodling av de isolerade befolkningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T för att AEC) och University of Texas i San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Flow cytometry
|
References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
