Клатрин эндоцитоза зависит от адаптера белков, которые координируют отбор грузов и клатрин сборки пальто. Здесь мы описываем процедуры для изучения адаптера клатрин физического взаимодействия и живые изображения ячейки подходов, используя в качестве модели дрожжей endocytic Sla1p белка адаптера.
Основные endocytic пути инициирует с образованием клатриновых везикулы (CCVS), которые перевозят грузы из клеточной поверхности, чтобы эндосомы 1-6. CCVS отличаются многогранным решетки клатрин, что пальто пузырьков мембраны и служит в качестве механического эшафот. Клатрин пальто собраны во время образования пузырьков из отдельных клатрин triskelia, растворимой формы клатрин состоит из трех тяжелых и три легких цепей субъединиц 7,8. Потому что трискелион не обладают способностью связываться с мембранной напрямую, клатрин-связывающий адаптеры имеют решающее значение для формирования ссылки клатрин решетки мембраны через ассоциацию с липидами и / или мембранных белков 9. Адаптеры также пакет трансмембранный белок грузов, таких как рецепторы, и могут взаимодействовать друг с другом и с другими компонентами образование ССГ техники 9.
Более двадцати клатрин адаптеры были описаны, некоторые из них участвуют в клатрин эндоцитоза и другие локализации в транс Гольджи сеть или эндосомы 9. За исключением HIP1R (дрожжи Sla2p), все известные клатрин адаптеры связываются с N-терминал-рулевых области клатрин тяжелой цепи 9. Клатрин адаптеры являются модульными белки, состоящие из сложенных области, связанные по неструктурированной гибкие линкеры. В рамках этих компоновщик регионах, короткие связывающие мотивы посредником взаимодействий с клатрин N-концевого домена или других компонентов везикул формирование техники 9. Два различных клатрин-связывающие мотивы были определены: клатрин ящик и W-поле 9. Консенсус клатрин коробки последовательность была первоначально определена как L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, но варианты были впоследствии обнаружены 11. W-поле соответствует последовательности PWxxW (где х означает каких-либо остатков).
Sla1p (Синтетический Смертельное с актином связывающий белок-1) был первоначально идентифицирован как актин связанных белков и необходим для нормальной структуры цитоскелета актина и динамика на endocytic сайтов в клетках дрожжей 12. Sla1p также связывает NPFxD endocytic сигнал сортировки и имеет решающее значение для эндоцитоза грузов подшипников NPFxD сигнал 13,14. Совсем недавно была продемонстрирована Sla1p связывать клатрин через мотив похож на клатрин окна LLDLQ, называемый вариант клатрин-бокс (VCB), и функционировать как endocytic клатрин адаптера 15. Кроме того, Sla1p стало широко используется маркер endocytic пальто в живой клетки флуоресцентной микроскопии исследования 16. Здесь мы используем Sla1p как модель для описания подходов для адаптера клатрин исследования взаимодействия. Мы ориентируемся на живой микроскопии флуоресценции клетки, GST-кадра, и ко-иммунопреципитации методами.
Клатриновых везикулы (ССГ) участвовать в эндоцитоза и транспорта из транс-Гольджи сеть и эндосомы, сохраняется путей, которые являются основополагающими для эукариотических клеточной биологии. Подходов, описанных в этой статье методы полезны для изучения молекулярных механизмо?…
The authors have nothing to disclose.
DF поддерживается NSF Мосты в доктора общения. Микроскоп используется в этой работе при частичной поддержке микроскоп изображений сети основной инфраструктуры грант Университета штата Колорадо. Работа над клатрин адаптеров в лаборатории автора с поддерживается ХСС стартовый капитал и американские награды ассоциации сердца 09SDG2280525 для SD
Material | Company |
---|---|
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
protease inhibitor cocktail | Sigma |