In vivo e in vitro di adattatore-clatrina Interazione

Summary

Clatrina endocitosi mediata dipende da proteine ​​adattatrici che coordinano la selezione delle merci e montaggio cappotto clatrina. Qui si descrivono le modalità di studio adattatore clatrina interazione fisica e l'imaging di cellule in vivo approcci utilizzando come modello il lievito endocitico Sla1p proteina adattatore.

Abstract

Un percorso importante endocitico inizia con la formazione di vescicole rivestite clatrina (CCV), che il trasporto merci dalla superficie cellulare di endosomi ^1-6. CCV sono caratterizzati da un reticolo poliedrico di clatrina che ricopre la membrana delle vescicole e serve come un dispositivo meccanico patibolo. Cappotti clatrina sono assemblati durante la formazione delle vescicole da individuo clatrina triskelia, la forma solubile di clatrina composta da tre subunità luce pesanti e tre catene ^7,8. Poiché il triscele non ha la capacità di legarsi alla membrana direttamente, clatrina vincolante adattatori sono fondamentali per collegare il reticolo che formano clatrina alla membrana attraverso l'associazione con i lipidi e / o di proteine ​​di membrana ^9. Adattatori anche il pacchetto di proteine ​​transmembrana carico, come i recettori, e possono interagire tra loro e con altri componenti della formazione CCV macchinari ^9.

Oltre venti adattatori clatrina sono stati descritti, molti sono coinvolti in clatrina endocitosi mediata e altri localizzare al Golgi trans rete o endosomi ^9. Con l'eccezione di HIP1R (lievito Sla2p), tutte le schede noto clatrina legarsi al N-terminale-elica dominio della catena clatrina pesante ^9. Adattatori clatrina sono proteine ​​modulare composto da domini piegato collegati da non strutturati linker flessibile. All'interno di queste regioni linker, brevi motivi vincolanti mediare le interazioni con la clatrina dominio N-terminale o altri componenti della formazione di vescicole macchinari ^9. Due distinti clatrina vincolanti motivi sono stati definiti: la clatrina-box e il W-box ^9. La clatrina-box sequenza consenso è stato originariamente definito come L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] ¹⁰ varianti, ma sono stati successivamente scoperti ^11. Il W-box è conforme al PWxxW sequenza (dove x è qualsiasi residuo).

Sla1p (letale sintetico con Actina binding protein-1) è stato originariamente identificato come una proteina actina associata ed è necessaria per la normale struttura del citoscheletro di actina e le dinamiche in siti endocitico in cellule di lievito ^12. Sla1p si lega anche il segnale NPFxD ordinamento endocitico ed è fondamentale per endocitosi di carico porta il segnale NPFxD ^13,14. Più recentemente, è stato dimostrato Sla1p legare clatrina attraverso un motivo simile alla finestra di clatrina, LLDLQ, definita una variante clatrina-box (VCB), e di funzionare come un adattatore endocitico clatrina ^15. Inoltre, Sla1p è diventato un indicatore ampiamente usato per il cappotto endocitico negli studi di microscopia a fluorescenza delle cellule vive ^16. Qui usiamo Sla1p come modello per descrivere approcci per l'adattatore-clatrina studi di interazione. Ci concentriamo sulla microscopia a fluorescenza delle cellule vive, GST-pull down, e co-immunoprecipitazione metodi.

Protocol

1. Inserimento di un tag GFP e marcatore nel gene SLA1

Applicare il metodo Longtine ¹⁷ per fondere un tag GFP direttamente alla fine del 3 'del telaio SLA1 lettura gene aperto (Sla1p C-terminale) e contemporaneamente segnare il gene con la E. coli kan ^r gene che consente la selezione G418.

1. Genera un frammento di DNA mediante PCR utilizzando come modello il plasmide pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 ¹⁸ e seguenti primer: in avanti, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 ', e reverse, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT GAA AAT TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'. La sequenza ha sottolineato corrisponde al segmento SLA1 gene specifico immediatamente precedente (forward primer) e seguendo il codone di stop (primer reverse). Isolare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio seguita da purificazione del DNA.
2. Preparare una da 50 ml cultura S. SEY6210 ceppo Saccharomyces (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, TRP1-Δ901, lys2-801, suc2 Δ9-GAL-MEL) ¹⁹ in YPD, crescendo a presto fase logaritmica (OD ₆₀₀ = 0,2-0,6). Spin a temperatura ambiente per 3 min a 2.000 xg, lavare due volte con acqua sterile.
3. Trasformare il frammento di PCR ottenuto al punto 1 nelle cellule utilizzando la procedura di acetato di litio ^20. Lavare le cellule con 1 ml di acqua sterile, aggiungere 1 ml YPD e incubare per 4 ore a 30 ° C in uno shaker.
4. Stendere le celle YPD-G418 piastre di selezionare per trasformanti G418 resistenti, incubare a 30 ° C per 2-3 giorni. Scegli colonie e strisciare li YPD-G418 piatti.
5. Utilizzando colonia-PCR, identificare trasformanti in cui la GFP-kan modulo è stato opportunamente integrato con la SLA1 sequenze geniche per ricombinazione omologa. Utilizzare un primer forward che annealing all'interno della cornice SLA1 lettura aperta e un primer reverse annealing che all'interno della GFP-kan modulo. Identificare le colonie che i prodotti di PCR sono le dimensioni previste e verificare mediante sequenziamento.
6. Schermo le colonie al microscopio a fluorescenza per confermare che hanno fluorescenza GFP.

2. Mutazione della scatola variante clatrina (VCB) nel gene SLA1

1. Introdurre un LLDLQ AAALQ ad una mutazione nel gene SLA1 (nucleotidi 2407-2415), seguendo un approccio in due fasi ^15.
2. In primo luogo, amplificare SLA1 nucleotidi 1207-1410 e 2427-2589 mediante PCR e clonare i frammenti all'interno di siti Noti / BamHI e EcoRI / Sali di pBluescriptKS, rispettivamente.
3. Sottoclone nel BamHI / EcoRI siti contenente un frammento di PCR URA3.
4. Incalzare il plasmide risultante con Noti / Sali, isolare il frammento URA3 da purificazione gel, e introdurlo mediante la trasformazione di acetato di litio nel Sla1-GFP ceppo generato nella parte 1, o in TVY614 (Mata ura3 leu2-52-3112-his3 Δ200 TRP1 -Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) ^21.
5. Stendere le celle integrate piastre SD manca l'uracile. Confermare con colonia-PCR e sequenziamento che il + colonie Ura contenere URA3 adeguatamente integrato sostituendo il frammento VCB.
6. In una seconda fase, sottoclone SLA1 nucleotidi 1207-2589 in Noti / Sali siti di pBluescriptKS. Utilizzando il QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene), mutano i residui VCB LLDLQ a AAALQ. Verificare mediante sequenziamento.
7. Incalzare il costrutto risultante con BsgI / AgeI, e isolare il VCB mutante contenente frammento di purificazione gel. Cotransform il BsgI / AgeI frammento con pRS313 (HIS3) ²² nel ceppo ricavato nella parte 2.3.
8. Stendere le celle integrate piastre SD manca istidina. La sua replica-piastra + colonie su terreno agarizzato contenente acido 5-fluorotic per identificare le cellule in cui le sequenze mutanti sostituito URA3, rigenerando così il sla1 gene contenente la mutazione di LLDLQ AAALQ (sla1 ^AAA). Confermare con colonia-PCR e sequenziamento.

3. Microscopia a fluorescenza

1. Crescere i ceppi di lievito Sla1-GFP e sla1 ^AAA-GFP generati nelle parti 1 e 2 in 4 ml di SD integrato dei media a 30 ° C in un rotatore al buio fino a raggiungere un diametro esterno ₆₀₀ = 0,1-0,4. Spin 1 ml di cultura in microcentrifuga a 4.000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. Scartare ~ 950 ml di sopranatante. Risospendere le cellule del liquido residuo (~ 50 ml).
2. Deposito 3 ml di sospensione cellulare su un vetrino da microscopio e coprire con un coprioggetto di vetro. Proteggere il campione dalla luce.
3. Montaggio di diapositive su un 100x ad immersione in olio obiettivo di una filatura-disco microscopio confocale.
4. Individuare corretta sul piano focale di cellule utilizzando illuminazione campo chiaro o 488 nm laser con filtri appropriati per eccitare e rilevare la fluorescenza di GFP.
5. Cattura time-lapse immagini di Sla1-GFP e sla1 ^AAA-GFP in cellule con tempo di esposizione di 500 ms (o il valore del caso) ad unn intervallo di un'immagine al secondo per 150 secondi. Risultato atteso: punctae GFP etichetta apparirà sulla superficie interna di limitare membrana della cellula, persistono per alcuni secondi, e spostare verso il centro della cellula, come il segnale scompare rapidamente (indicando cappotto smontaggio).
6. Selezionare una porzione di un'immagine in cui si vedono macchie di apparire, rimangono per alcuni secondi, e sparire. Ritaglia questa sezione dell'immagine per ogni fotogramma del time-lapse immagini.
7. Generare un chimografo rappresenta questa sezione dell'immagine in ogni fotogramma del secondo 150 time-lapse immagine allineando le cornici lungo un asse corrispondente al tempo trascorso.
8. Calcolare la durata di ogni luogo in base a quanti secondi (time-lapse frames) i punti è presente nel chimografo. Si noti che ogni punto dovrebbe "curva" verso l'interno della cellula come sta scomparendo, riflettendo endocitosi e lo smontaggio del mantello.
9. Confronta tipo selvatico Sla1-GFP con sla1 ^AAA-GFP. Ripetere l'operazione per determinare se i risultati sono statisticamente significativi. Risultato atteso: sla1 ^AAA-GFP macchie persistono significativamente più lunga (~ 80 sec) di tipo selvatico (~ 30 sec) che indicano un difetto nella formazione del mantello ^15.

4. Preparazione di estratto di lievito citosolica ed estrarre cellule totale

1. Inoculare 3 litri di YPD con un ceppo di lievito appropriato, come TVY614 ^21, e crescere a 30 ° C in un incubatore shaker fino a raggiungere un diametro esterno ₆₀₀ = 1-2.
2. Centrifugare la cultura lievito a temperatura ambiente per 20 minuti a 3.700 x g. Eliminare il supernatante, aggiungere 3-5 ml di acqua sterile, e pipetta su e giù fino a quando il pellet è completamente risospeso.
3. Versare circa 150 ml di azoto liquido in un becher da 250 ml di plastica. Flash-congelare il lievito, aggiungendo goccia a goccia in azoto liquido in un modello circolare per evitare di agglutinazione del pellet congelato. Non lasciate che il disgelo pellets, aggiungere azoto liquido più se necessario.
4. Raffreddare un contenitore in acciaio inox frullatore versando azoto liquido in esso. Consentire l'azoto liquido per far evaporare quasi completamente. Aggiungere il lievito pellet congelato al contenitore freddo frullatore. Chiudere il contenitore frullatore con un tappo di gomma fredda e macinare il pellet di lievito per 10 secondi. Invertire i tempi contenitore 3-4 a mescolare i contenuti e ripetere la fase della macinatura due volte. Il lievito terreno ghiacciato avrà una polvere-come l'apparenza.
5. Freddo un imbuto e un tubo da 50 ml coniche con azoto liquido. Utilizzando l'imbuto freddo, trasferire il lievito di terra al tubo. Il lievito terreno ghiacciato può conservare a -80 ° C o utilizzato immediatamente.
6. Per ottenere un estratto citosolico per la GST-fusione dosaggio di proteine ​​affinità (parte 5), peso 3 g di terreno ghiacciato TVY614 lievito in un tubo da 15 ml e risospendere in 3 ml di tampone a temperatura ambiente A (10 HEPES mM, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) cocktail contenenti inibitori della proteasi (Sigma).
7. Tappo e capovolgere il tubo più volte fino a quando completamente scongelati e poi messo in ghiaccio.
8. Ultracentrifuga l'estratto a 4 ° C per 20 min a 300.000 x g. Con attenzione trasferire il sopranatante (estratto citosolico) ad un tubo conico con una pipetta senza disturbare il pellet. Mantenere l'estratto citosolico sul ghiaccio.
9. Aggiungere 100 ml di un (v / v) 50% glutatione-Sepharose liquami in tampone A. E 'conveniente tagliare l'estremità della punta in modo da facilitare pipeting le perline. Ruota a 4 ° C per 15 minuti, spin-down le perle per centrifugazione a 4 ° C per 2 min a 1.000 xg, e trasferire i (estratto citosolico) surnatante in una nuova provetta. Riserva del 50 ml di estratto per il controllo di input.
10. Per ottenere estratti cellulari totali per il co-immunoprecipitazione esperimenti (punto 6) utilizzare ceppo TVY614 (WT SLA1), il ceppo sla1 ^AAA che trasporta un LLDLQ ad una mutazione AAALQ generato nella parte 2 a TVY614 sfondo, e un ceppo sla1 portando una cancellazione del SLA1 gene come GPY3130 ^23. Peso 2 g di lievito corrispondente terreno ghiacciato in tubi conici e risospendere in 2 ml di tampone a temperatura ambiente A, contenente cocktail inibitore delle proteasi (Sigma) e il 2% Triton X-100.
11. Tappo e capovolgere il tubo più volte fino a quando completamente scongelati e poi incubare in ghiaccio per 10 minuti, mescolando periodicamente per inversione.
12. Trasferire il materiale in tubi da microcentrifuga e far girare a 4 ° C per 15 minuti a 16.000 xg (velocità massima in microcentrifuga). Con attenzione trasferire il sopranatante (estratto totale della cella) in una provetta conica sul ghiaccio con una pipetta senza disturbare il pellet.
13. Aggiungere 100 ml di una proteina al 50% (v / v) A-Sepharose liquami in tampone A. Ruota a 4 ° C per 15 minuti, spin-down le perle per centrifugazione a 4 ° C per 2 min a 1.000 xg, e il trasferimento il surnatante (estratto in totale) in una nuova provetta. Riserva del 50 ml di estratto per il controllo di input.

5. Proteina di fusione GST-test affinità

1. Amplificare mediante PCR un frammento containing la variante Sla1p clatrina-box (VCB) (residui 803-807), si clone in pGEX-5X per ottenere pGEX-5X-VCB. Verificare mediante sequenziamento.
2. Utilizzando pGEX-5X-VCB come modello e il QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene), mutare il VCB residui LLDLQ per AAALQ di ottenere pGEX-5X-vCBmut. Verificare mediante sequenziamento.
3. Esprimere GST e le proteine ​​di fusione GST-VCB e GST-vCBmut in E. coli (BL21 DE3), purificare utilizzando glutatione-Sepharose, eluire dalla perline con glutatione ridotto, Dializzare contro PBS, e determinare la concentrazione di proteine.
4. Etichetta 3 tubi da microcentrifuga: GST, GST-VCB, e GST-vCBmut, e aggiungere 1 ml di PBS, 30 ml di un 50% (v / v) glutatione-Sepharose liquami in tampone A, e 50 mcg di dialized GST, GST -VCB, o GST-vCBmut proteine ​​di fusione.
5. Ruota a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire vincolanti.
6. Lavare le perle 2 volte con PBS e 1 volta con tampone A. Aggiungere 1 ml di estratto di lievito citosolica - preparato come descritto nella parte 4 - ad ogni provetta.
7. Ruotare i tubi di 1 ora a 4 ° C, rotazione 10 sec a 5.000 xg per far sedimentare le perline, scartare il surnatante e lavare rapidamente le perle 3 volte con tampone A contenente 0,1% di tempo Triton X-100, e 1 con tampone A.
8. Spin giù le perle ancora una volta e con una punta di carico gel rimuovere quanto più liquido possibile. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C per continuare in un secondo momento.
9. Aggiungere 15 ml di tampone 2x campione Laemmli a ciascuna provetta, incubare a 96 ° C per 5 minuti, e spin 10 sec a 5.000 x g.
10. Analizzare i campioni da immunoblotting utilizzando un anticorpo alla catena clatrina pesante. Risultati attesi: si lega clatrina a GST-VCB ma non per GST o GST-vCBmut. Anche analizzare i campioni da SDS-PAGE per confermare carico simile di proteine ​​di fusione GST.

6. Co-immunoprecipitazione test

1. Etichetta 3 tubi microcentrifuga: WT (tipo selvaggio SLA1), sla1 ^AAA, e sla1Δ, e aggiungere 1 ml di PBS, 30 ml di un 50% (v / v) di proteina A-Sepharose liquami in tampone A, e 2 mg di coniglio anti-Sla1p anticorpi.
2. Ruota a temperatura ambiente per 30 min.
3. Lavare le perle due volte con PBS e 1 volta con tampone A contenente 1% Triton X-100.
4. Aggiungere 1 ml di estratti di lievito corrispondente totale preparato Parte 4: SLA1, sla1 ^AAA, e sla1Δ. Ruota 1 ora a 4 ° C.
5. Spin 10 sec a 5.000 xg per far sedimentare le perline, scartare il surnatante e lavare rapidamente le perle 3 volte con un tampone contenente 0,1% Triton X-100, e 1 volta con tampone A.
6. Spin giù le perle ancora una volta e con una punta di carico gel rimuovere quanto più liquido possibile. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C per continuare in un secondo momento.
7. Aggiungere 15 ml di tampone 2x campione Laemmli a ciascuna provetta, incubare a 96 ° C per 5 minuti, e spin 10 sec a 5.000 x g.
8. Analizzare i campioni da immunoblotting utilizzando un anticorpo alla catena clatrina pesante. Risultati attesi: clatrina co-immunoprecipitati con Sla1p wild-type, ma non con sla1 ^AAA, o nel campione sla1Δ.

7. Rappresentante Risultati

Figura 1. Analisi di adattatore Sla1p clatrina nei siti endocitico mediante microscopia a fluorescenza delle cellule vive. Un fotogramma (a sinistra) da un video e kymographs corrispondente (a destra) di cellule di lievito che esprimono Sla1-GFP o sla1 ^AAA-GFP che trasporta un LLDLQ alla mutazione AAALQ. Sia di tipo selvatico e mutante Sla1-GFP sono stati espressi dal endogeno SLA1 locus. Siti endocitico sono osservati come punti luminosi distribuiti nella periferia cellulare (immagini a sinistra). L'area tra le linee bianche corrisponde alla regione da cui sono stati generati kymographs. I film sono stati presi ad un frame rate di 1 frame / sec. Si noti la maggiore durata di Sla1-GFP nel LLDLQ a AAALQ mutante (sla1 ^AAA) rispetto al wild-type (SLA1).

Figura 2. Interazione fisica tra clatrina e la Sla1p variante box clatrina. GST fusa Sla1p frammento aa798-813 contenente la sequenza LLDLQ (GST-VCB), il corrispondente AAALQ mutante (GST-vCBmut), da soli o GST (GST) sono stati tenuti a glutatione-Sepharose perline e incubate con un estratto citosolico da wild- tipo di cellule di lievito. Le proteine ​​associate sono stati eluiti ed analizzati mediante immunoblotting (IB) per clatrina catena pesante.

Discussion

Clatrina rivestite vescicole (CCV) partecipare endocitosi e trasporto dal trans Golgi rete e endosomi, percorsi conservate che sono fondamentali per la biologia delle cellule eucariotiche. Gli approcci descritti in questo documento i metodi sono utili per studiare i meccanismi molecolari responsabili della formazione CCV, in particolare le interazioni tra proteine ​​adattatore e clatrina. GST-fusione affinità proteine ​​e co-immunoprecipitazione test permettono di prova per l'associazione fisica tra un adattatore (candidati) e clatrina. GFP-tagging e di imaging microscopia a fluorescenza consentono studi dinamici in cellule vive. Le cellule di lievito in particolare, offrono il vantaggio di facile manipolazione genetica di introdurre tag e le mutazioni nel gene endogeno adattatore mantenendo così normale regolazione dell'espressione della proteina tag / mutato. Allo stesso modo, i componenti clatrina o l'altra delle CCV possono essere contrassegnate con RFP o altre proteine ​​fluorescenti per facilitare gli studi di imaging a doppia nelle cellule viventi ^16.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit	Stratagene
protease inhibitor cocktail	Sigma