Summary
क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis अनुकूलक प्रोटीन है कि माल चयन और क्लैथ्रिन कोट विधानसभा समन्वय पर निर्भर करता है. यहाँ हम प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए एडाप्टर क्लैथ्रिन शारीरिक संपर्क और जीना सेल इमेजिंग दृष्टिकोण एक मॉडल के रूप में खमीर endocytic अनुकूलक प्रोटीन Sla1p का उपयोग का अध्ययन.
Protocol
1. GFP और SLA1 जीन में चयन मार्कर टैग के निगमन
Longtine 17 विधि लागू करने में एक GFP टैग सीधे SLA1 जीन खुला पढ़ने फ्रेम के 3 'अंत (Sla1p सी-टर्मिनस) पर और एक साथ फ्यूज ई. के साथ जीन के निशान कोलाई कण आर जीन है कि G418 चयन के लिए अनुमति देता है.
- पीसीआर द्वारा एक डीएनए टुकड़ा प्लाज्मिड pFA6a (S65T) - GFP-kanMX6 18 और निम्न प्राइमरों का उपयोग एक टेम्पलेट के रूप में उत्पन्न: आगे, 5'-ca AGG CAA जीसीसी AAC एटीए टीटीसी AAT GCT अधिनियम GCA TCA AAT CCG TTT GGA टीटीसी CGG एटीसी सीसीसी GGG TTA ATT ए.ए. 3 ', और रिवर्स, 5'-सीए जैसे AGC TTG TTT टैग TTA TTA टीसीसी जैसे एएए एटीसी TTA एएए टीएसी ATT AAT GAA टीटीसी भूमिकाः सीटीसी GTT TAA एसी-3'. रेखांकित अनुक्रम SLA1 जीन विशिष्ट खंड तुरंत (आगे प्राइमर) पूर्ववर्ती और रोक codon (रिवर्स प्राइमर) के बाद से मेल खाती है है. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद डीएनए शुद्धीकरण के बाद पृथक.
- एक 50 मिलीलीटर संस्कृति एस तैयार cerevisiae SEY6210 (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3 Δ200, trp1 Δ901, lys2 801, suc2 Δ9 लड़की - एमईएल) तनाव YPD में 19, जल्दी लघुगणक चरण (600 आयुध डिपो 0.2-0.6 =) पर बढ़ रहा है. 2,000 XG पर 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्पिन, बाँझ पानी के साथ दो बार धो लो.
- पीसीआर लिथियम एसीटेट 20 प्रक्रिया का उपयोग कर कक्षों में चरण 1 में प्राप्त टुकड़ा रूपांतरण. 1 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ कोशिकाओं को धो, 1 मिलीलीटर YPD और 30 में 4 घंटे के लिए सेते ° सी एक प्रकार के बरतन में जोड़ें.
- YPD-G418 प्लेटों पर कोशिकाओं फैलाओ G418 प्रतिरोधी transformants है, 2-3 दिनों के लिए 30 ° C पर सेते के लिए चयन. YPD-G418 प्लेटों पर कालोनियों और उन्हें लकीर उठाओ.
- का प्रयोग कॉलोनी-पीसीआर, transformants GFP - कण मॉड्यूल में जो ठीक से मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा SLA1 जीन दृश्यों के साथ एकीकृत किया गया था की पहचान. आगे एक प्राइमर का उपयोग करें कि SLA1 खुला पढ़ने फ्रेम और एक रिवर्स प्राइमर है कि भीतर anneals GFP - कण मॉड्यूल के अंदर anneals. जो पीसीआर उत्पादों उम्मीद आकार और अनुक्रमण द्वारा सत्यापित कालोनियों को पहचानें.
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कालोनियों को स्क्रीन की पुष्टि के लिए वे GFP प्रतिदीप्ति है.
2. संस्करण क्लैथ्रिन बॉक्स (VCB) के SLA1 जीन में उत्परिवर्तन
- LLDLQ AAALQ SLA1 एक दो कदम दृष्टिकोण 15 के बाद (2407-2415 nucleotides) जीन में उत्परिवर्तन के लिए एक परिचय.
- सबसे पहले, SLA1 1207-1410 और पीसीआर द्वारा 2427-2589 nucleotides बढ़ाना और pBluescriptKS चना / BamHI और / EcoRI Sali साइटों में टुकड़े क्लोन, क्रमशः.
- BamHI / EcoRI एक पीसीआर URA3 युक्त टुकड़ा साइटों में Subclone.
- चना / साली के साथ जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड फोड़ना, जेल शुद्धि द्वारा URA3 टुकड़ा अलग है, और यह लिथियम Sla1 - GFP भाग 1 में, या TVY614 (माता ura3-52 leu2 3112 trp1 his3 - Δ200 में उत्पन्न तनाव में एसीटेट परिवर्तन से परिचय Δ901 pep4 suc2 - Δ9 lys2 801:: LEU2 prb1: HISG prc1: HIS3) 21.
- पूरक एसडी uracil कमी प्लेटों पर कोशिकाओं बिखरा हुआ है. कॉलोनी - पीसीआर द्वारा पुष्टि करें और अनुक्रमण है कि ura + कालोनियों VCB टुकड़ा जगह ठीक से एकीकृत URA3 होते हैं.
- चरण में एक दूसरे subclone SLA1 nucleotides 1207-2589 pBluescriptKS चना / Sali साइटों में. का प्रयोग QuickChange - एक्स्ट्रा लार्ज साइट निर्देशित mutagenesis के किट (Stratagene), VCB अवशेषों AAALQ LLDLQ रूप बदलना. अनुक्रमण द्वारा सत्यापित करें.
- फोड़ना BSGI / AgeI के साथ जिसके परिणामस्वरूप निर्माण, और उत्परिवर्ती VCB युक्त जेल शुद्धि द्वारा टुकड़ा अलग. 2.3 पार्ट में प्राप्त तनाव में pRS313 (HIS3) 22 के साथ टुकड़ा / BSGI AgeI Cotransform.
- पूरक एसडी हिस्टडीन कमी प्लेटों पर कोशिकाओं बिखरा हुआ है. प्रतिकृति प्लेट उनकी अगर 5 fluorotic एसिड युक्त कोशिकाओं है जिसमें उत्परिवर्ती दृश्यों URA3 जगह है, इस प्रकार regenerating sla1 AAALQ उत्परिवर्तन (sla1 एएए) के LLDLQ युक्त जीन की पहचान मध्यम पर + कालोनियों. कॉलोनी के पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि करें.
3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
- खमीर उपभेदों एक आयुध डिपो 600 0.1-0.4 = तक पहुँचने तक Sla1 - GFP और एएए GFP sla1 भाग 1 और 2 पूरक एसडी मीडिया के 4 मिलीलीटर में 30 ° अंधेरे में एक अंग को घुमानेवाली पेशी में सी में उत्पन्न हो जाओ . Microcentrifuge में कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 4,000 XG पर संस्कृति के 1ml स्पिन. ~ सतह पर तैरनेवाला 950 μl त्यागें. शेष तरल (~ 50 μl) में कोशिकाओं Resuspend.
- जमा एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर सेल निलंबन के 3 μl और एक गिलास coverslip के साथ कवर. प्रकाश से नमूना सुरक्षित रखें.
- माउंट उद्देश्य तेल विसर्जन एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के एक 100x पर स्लाइड.
- उपयुक्त फिल्टर के साथ brightfield रोशनी या 488 एनएम लेजर का उपयोग करने के लिए उत्तेजित और GFP से प्रतिदीप्ति का पता लगाने की कोशिकाओं के सही नाभीय विमान का पता लगाएँ.
- 500 एमएस के जोखिम समय (या उचित मूल्य) के साथ कोशिकाओं में Sla1 GFP और एएए GFP sla1 समय चूक छवियों पर कब्जा150 सेकंड के लिए एक छवि प्रति सेकंड के अंतराल पता. अपेक्षित परिणाम: GFP लेबल punctae सेल की झिल्ली सीमित की भीतरी सतह पर दिखाई देते हैं, कई सेकंड के लिए जारी रहती है, और सेल के केंद्र की ओर कदम के रूप में संकेत जल्दी से गायब हो जाता है (कोट disassembly संकेत).
- जिसमें धब्बे दिखाई देते हैं, कई सेकंड के लिए रहते हैं, और गायब में देखा जाता है एक छवि के एक हिस्से का चयन करें. समय चूक छवियों के प्रत्येक फ्रेम के लिए छवि के इस खंड फसल.
- एक elapsed समय के लिए इसी अक्ष के साथ फ्रेम aligning से 150 दूसरी छवि समय चूक की प्रत्येक फ्रेम में छवि के इस खंड का प्रतिनिधित्व kymograph उत्पन्न करता है.
- प्रत्येक कितने सेकंड स्पॉट (समय चूक फ्रेम) kymograph में मौजूद है के आधार पर मौके की अवधि की गणना. ध्यान दें कि हर जगह सेल के इंटीरियर की ओर "वक्र" चाहिए के रूप में यह गायब है, और कोट के disassembly endocytosis को दर्शाती है.
- एएए GFP sla1 के साथ जंगली प्रकार Sla1 - GFP की तुलना करें . यदि परिणाम के सांख्यिकीय महत्वपूर्ण हैं निर्धारित करने के लिए दोहराएँ. उम्मीद परिणाम: sla1 एएए GFP धब्बे काफी अब जंगली प्रकार (~ 30 सेकंड) कोट 15 गठन में एक दोष का संकेत से (~ 80 सेकंड) जारी रहती है .
4. खमीर साइटोसोलिक निकालने और कुल सेल निकालने की तैयारी
- एक उचित खमीर तनाव, जैसे 21 TVY614 के साथ YPD के 3 लीटर का टीका लगाना, और 30 में बढ़ती ° एक 600 आयुध डिपो 1-2 = तक पहुँचने तक एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में सी.
- 3700 x छ पर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खमीर संस्कृति अपकेंद्रित्र . सतह पर तैरनेवाला त्यागें, बाँझ पानी के 3-5 मिलीलीटर जोड़ने, और विंदुक ऊपर और नीचे जब तक पूरी तरह से गोली resuspended है.
- ~ तरल नाइट्रोजन की एक 250 मिलीलीटर प्लास्टिक बीकर में 150 मिलीलीटर डालो. फ्लैश फ्रीज dropwise जोड़ने के लिए एक परिपत्र पैटर्न में तरल नाइट्रोजन में जमे हुए छर्रों का समूहन से बचने के द्वारा खमीर. छर्रों पिघलना, और अधिक तरल नाइट्रोजन जोड़ने यदि आवश्यक मत करो.
- यह तरल नाइट्रोजन में गिरने से एक स्टेनलेस स्टील ब्लेंडर कंटेनर शांत रहो. तरल नाइट्रोजन लगभग पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें. ठंड ब्लेंडर कंटेनर के लिए जमे हुए खमीर छर्रों जोड़ें. एक ठंड रबड़ डाट के साथ ब्लेंडर कंटेनर बंद करें और 10 सेकंड के लिए खमीर छर्रों पीसने. कंटेनर में 3-4 बार उलटें सामग्री और मिश्रण पीस कदम दो बार दोहराने के लिए. जमीन जमी खमीर पाउडर की तरह एक उपस्थिति होगा.
- और तरल नाइट्रोजन के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कीप शांत रहो. ठंड कीप का प्रयोग, ट्यूब के लिए जमीन खमीर हस्तांतरण. जमे हुए जमीन खमीर स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस या तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है.
- जीएसटी-संलयन प्रोटीन आत्मीयता (भाग 5) परख, वजन जमी जमीन के 3 जी एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में TVY614 खमीर और कमरे के तापमान बफर के 3 मिलीलीटर में resuspend के लिए एक साइटोसोलिक निकालने प्राप्त करने के लिए (10 मिमी HEPES, 7.0 पीएच, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी डीटीटी) protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल (सिग्मा) युक्त.
- कैप और ट्यूब कई बार जब तक पूरी तरह thawed है और फिर बर्फ पर डाल पलटना.
- 4 में निकालने ultracentrifuge ° सी 300.000 पर 20 मिनट के लिए एक्स जी ध्यान गोली परेशान बिना एक शंक्वाकार एक विंदुक का उपयोग ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला साइटोसोलिक (निकालने). बर्फ पर साइटोसोलिक निकालने रखें.
- एक 50% (v / v) बफर ए में घोल glutathione Sepharose यह टिप के अंत में कटौती क्रम में मोती pipeting की सुविधा के लिए सुविधाजनक है की 100 μl जोड़ें. 4 में घुमाएँ डिग्री सेल्सियस के लिए 15 मिनट, 4 पर centrifugation द्वारा मोती स्पिन डाउन ° सी 1000 XG में 2 मिनट, और सतह पर तैरनेवाला (साइटोसोलिक निकालने) एक ताजा ट्यूब को हस्तांतरण के लिए. रिजर्व इनपुट नियंत्रण के लिए निकालने के 50 μl.
- सह immunoprecipitation प्रयोगों के लिए कुल सेल के अर्क (भाग 6) को प्राप्त करने के लिए, तनाव TVY614 (SLA1 WT), sla1 एएए AAALQ उत्परिवर्तन TVY614 पृष्ठभूमि में भाग 2 में उत्पन्न एक LLDLQ ले जाने तनाव, और एक sla1 तनाव ले जाने के एक विलोपन का उपयोग करें SLA1 23 GPY3130 रूप में इस तरह के जीन . वजन इसी शंक्वाकार ट्यूबों में जमे हुए जमीन खमीर के 2 जी और उन्हें कमरे के तापमान बफर के 2 मिलीलीटर में resuspend एक protease अवरोध करनेवाला (सिग्मा) कॉकटेल और 2% Triton एक्स 100-युक्त.
- कैप और ट्यूब कई बार पलटना जब तक पूरी तरह thawed है और फिर 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, समय - समय पर उलटा द्वारा मिश्रण.
- Microcentrifuge ट्यूबों और स्पिन करने के लिए 4 में स्थानांतरण सामग्री ° सी १६००० XG (microcentrifuge में शीर्ष गति) पर 15 मिनट के लिए. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला (कुल सेल निकालने) हस्तांतरण गोली परेशान बिना एक चोटीदार ट्यूब के लिए बर्फ पर एक विंदुक का उपयोग.
- 4 में घुमाएँ बफर ए में एक 50% (v / v) प्रोटीन A-Sepharose घोल के 100 μl जोड़ें ° सी 15 मिनट के लिए, स्पिन डाउन हज़ार XG पर 2 मिनट के लिए 4 पर centrifugation द्वारा मोती ° सी, और हस्तांतरण एक ताजा ट्यूब (कुल निकालने) सतह पर तैरनेवाला. रिजर्व इनपुट नियंत्रण के लिए निकालने के 50 μl.
5. जीएसटी संलयन प्रोटीन आत्मीयता परख
- पीसीआर एक टुकड़ा containi द्वारा बढ़ानाएनजी Sla1p क्लैथ्रिन बॉक्स संस्करण (VCB) (803-807 अवशेषों), यह pGEX-5X में क्लोन pGEX-5X - VCB प्राप्त. अनुक्रमण द्वारा सत्यापित करें.
- एक टेम्पलेट के रूप में pGEX-5X - VCB का प्रयोग और QuickChange - एक्स्ट्रा लार्ज mutagenesis के किट (Stratagene) साइट निर्देश, AAALQ VCB अवशेषों LLDLQ रूप बदलना pGEX-5X - vCBmut प्राप्त. अनुक्रमण द्वारा सत्यापित करें.
- एक्सप्रेस जीएसटी और संलयन प्रोटीन जीएसटी VCB और ई. में जीएसटी के vCBmut कोली (DE3 BL21), कम glutathione के साथ मोती से glutathione - Sepharose, elute का उपयोग कर शुद्ध, Pbs के खिलाफ dialyze, और प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण .
- लेबल microcentrifuge 3 ट्यूबों: जीएसटी, जीएसटी VCB, और जीएसटी - vCBmut, और पीबीएस के 1 मिलीग्राम, 50% (v / v) बफर में घोल glutathione Sepharose के 30 μl dialized जीएसटी, जीएसटी के एक और 50 μg जोड़ने , या जीएसटी vCBmut संलयन प्रोटीन VCB.
- के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देने के 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घुमाएँ.
- मोती बफर ए के साथ धो PBS के साथ 2 बार और 1 बार खमीर साइटोसोलिक निकालने के 1 मिलीलीटर जोड़ें - तैयार के रूप में भाग 4 में वर्णित प्रत्येक ट्यूब.
- ट्यूबों ५,००० गोली मोती XG 1 4 घंटे ° सी, स्पिन 10 सेकंड घुमाएँ, सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए, और जल्दी से मोती बफर ए के साथ बफर के साथ 3 बार एक युक्त 0.1% Triton एक्स 100 और 1 धो
- नीचे मोती एक और अधिक समय और एक जेल लोड हो रहा है टिप का उपयोग संभव के रूप में अधिक तरल पदार्थ के रूप हटायें स्पिन. इस बिंदु पर नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है एक बाद में समय पर जारी.
- प्रत्येक ट्यूब, 96 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए सेते 2x Laemmli नमूना बफर के 15 μl जोड़ें, और ५००० एक्स जी 10 सेकंड स्पिन
- क्लैथ्रिन भारी श्रृंखला के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoblotting द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें. अपेक्षित परिणाम नहीं बल्कि जीएसटी या जीएसटी - vCBmut क्लैथ्रिन जीएसटी - VCB को बांधता है. इसके अलावा, एसडीएस पृष्ठ से नमूनों का विश्लेषण करने के लिए जीएसटी संलयन प्रोटीन के समान लोड हो रहा है की पुष्टि.
6. सह - immunoprecipitation परख
- लेबल 3 microcentrifuge ट्यूबों: (जंगली प्रकार SLA1) WT, sla1 एएए, और sla1Δ, और पीबीएस के 1 मिलीग्राम, बफर में एक 50% (v / v) एक - Sepharose घोल प्रोटीन के 30 μl एक के ए, और 2 μg जोड़ने खरगोश प्रतिरक्षी विरोधी - Sla1p.
- 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घुमाएँ.
- पीबीएस और एक युक्त% 1 Triton एक्स 100-बफर के साथ 1 समय के साथ मोती दो बार धो.
- SLA1, एएए sla1, और sla1Δ: इसी कुल खमीर भाग 4 में तैयार अर्क के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 1 4 घंटे ° सी. घुमाएँ
- स्पिन 10 सेकंड 5000 में गोली मोती XG, सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए, और जल्दी से मोती बफर के साथ 3 बार धोने एक युक्त 0.1% Triton एक्स 100, और बफर ए के साथ 1 समय
- नीचे मोती एक और अधिक समय और एक जेल लोड हो रहा है टिप का उपयोग संभव के रूप में अधिक तरल पदार्थ के रूप हटायें स्पिन. इस बिंदु पर नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है एक बाद में समय पर जारी.
- प्रत्येक ट्यूब, 96 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए सेते 2x Laemmli नमूना बफर के 15 μl जोड़ें, और ५००० एक्स जी 10 सेकंड स्पिन
- क्लैथ्रिन भारी श्रृंखला के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoblotting द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें. परिणाम की उम्मीद: क्लैथ्रिन एएए sla1, या sla1Δ नमूने में जंगली प्रकार Sla1p के साथ के साथ नहीं बल्कि सह immunoprecipitates.
7. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 Sla1p क्लैथ्रिन एडाप्टर के रहते सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा endocytic स्थलों पर विश्लेषण. वीडियो इसी kymographs (दाएं) और खमीर कोशिकाओं व्यक्त Sla1 GFP या एएए GFP sla1 AAALQ उत्परिवर्तन के लिए एक LLDLQ ले जाने के एक फ्रेम (बाएं) . दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती Sla1 - GFP अंतर्जात SLA1 बिन्दुपथ से व्यक्त किया गया. Endocytic साइटों सेल परिधि (बाएँ छवियों) में वितरित उज्ज्वल स्पॉट के रूप में मनाया जाता है. सफेद लाइनों के बीच क्षेत्र जो इस क्षेत्र से kymographs उत्पन्न थे के लिए मेल खाती है. सिनेमा 1 फ्रेम / सेकंड के एक फ्रेम दर पर ले जाया गया. सूचना AAALQ उत्परिवर्ती (sla1 एएए) LLDLQ में अब Sla1 - GFP के जंगली प्रकार (SLA1) की तुलना में जीवन भर.
चित्रा 2 क्लैथ्रिन और Sla1p संस्करण क्लैथ्रिन बॉक्स के बीच शारीरिक संपर्क है. जीएसटी aa798-813 टुकड़ा अनुक्रम LLDLQ (जीएसटी - VCB), इसी AAALQ उत्परिवर्ती (जीएसटी - vCBmut), या जीएसटी अकेले (जीएसटी) से युक्त Sla1p जुड़े थे glutathione - Sepharose मोती के लिए बाध्य और जंगली से साइटोसोलिक निकालने के साथ incubated प्रकार खमीर कोशिकाओं. जुड़े प्रोटीन eluted थे और क्लैथ्रिन भारी श्रृंखला के लिए immunoblotting (आईबी) के द्वारा विश्लेषण.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
क्लैथ्रिन लेपित vesicles (CCV) endocytosis और पार Golgi नेटवर्क से परिवहन में भाग लेने और endosomes, संरक्षित मार्ग है कि यूकेरियोटिक कोशिका जीव विज्ञान के लिए मौलिक हैं. इस तरीके कागज में वर्णित दृष्टिकोण CCV गठन के लिए जिम्मेदार है, एडाप्टर प्रोटीन और क्लैथ्रिन के बीच विशेष बातचीत में आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं. जीएसटी-संलयन प्रोटीन आत्मीयता और सह - immunoprecipitation assays (उम्मीदवार) एडाप्टर और क्लैथ्रिन के बीच शारीरिक संबंध के लिए परीक्षण की अनुमति देते हैं. GFP-टैगिंग और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग जीवित कोशिकाओं में गतिशील के अध्ययन की अनुमति. विशेष रूप से खमीर कोशिकाओं आसान आनुवंशिक हेरफेर के लाभ के लिए एडाप्टर अंतर्जात इस प्रकार टैग / उत्परिवर्तित प्रोटीन की सामान्य अभिव्यक्ति विनियमन बनाए रखने के जीन में टैग और म्यूटेशनों परिचय प्रदान करते हैं. इसी तरह, CCV के क्लैथ्रिन या अन्य घटकों आरएफपी या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया जा सकता है रहने वाले 16 कोशिकाओं में दोहरी इमेजिंग अध्ययन की सुविधा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लोमो डॉक्टरेट फैलोशिप के लिए एक NSF पुल द्वारा समर्थित है. इस काम में इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी भाग में माइक्रोस्कोप इमेजिंग नेटवर्क कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय से कोर बुनियादी ढांचे अनुदान द्वारा समर्थित है. लेखक की प्रयोगशाला में क्लैथ्रिन एडेप्टर पर काम शुरू हुआ धन और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन एसडी 09SDG2280525 पुरस्कार CSU द्वारा समर्थित है
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
References
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
- Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
- Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
- Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
- Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
- Dell'Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network! Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
- Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
- Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
- Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i, Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
- Pietro, S. M. D. i, Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
- Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
- Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
- Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
- Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
