Clathrin בתיווך אנדוציטוזה תלוי חלבונים מתאם לתאם מבחר מטען הרכבה מעיל clathrin. כאן אנו מתארים את נוהלי ללמוד מתאם-clathrin אינטראקציה פיזית הדמיה תא חי באמצעות גישות כמודל מתאם endocytic שמרים Sla1p חלבון.
מסלול endocytic הגדולות יוזם עם הקמתה של clathrin מצופה שלפוחית (CCVs) כי מטען הובלה מתא השטח כדי endosomes 1-6. CCVs מאופיינים סריג polyhedral של clathrin קרום כי שלפוחית מעילים משמש פיגום מכני. מעילים Clathrin נאספו במהלך היווצרות שלפוחית מ triskelia clathrin הפרט, את הטופס מסיסים של clathrin מורכבת משלושה כבד ושלושה שרשרת אור יחידות משנה 7,8. מכיוון triskelion אין את היכולת לאגד הממברנה ישירות, clathrin מחייב מתאמים הן קריטיות הקישור סריג clathrin להרכיב את הממברנה דרך בשיתוף עם שומנים ו / או חלבונים בממברנה 9. מתאמי גם הטרנסממברני חבילת מטען חלבון, כגון קולטנים, והוא יכול לתקשר אחד עם השני וגם עם רכיבים אחרים של היווצרות CCV מכונות 9.
מעל עשרים מתאמי clathrin תוארו, מספר מעורבים אנדוציטוזה מתווכת clathrin ואחרים למקם את Golgi טרנס רשת או endosomes 9. למעט HIP1R (שמרים Sla2p), כל המתאמים clathrin ידוע להיקשר תחום הטרמינל-N-המדחף של שרשרת כבדה clathrin 9. מתאמי Clathrin הם חלבונים מודולרי המורכב תחומים מקופל המחוברים באמצעות linkers גמישה מובנה. בתוך האזורים הללו והמקשר, מוטיבים מחייב לתווך קצר אינטראקציות עם תחום ה-N-מסוף clathrin או רכיבים אחרים של היווצרות שלפוחית מכונות 9. שני ברורים clathrin מחייב מוטיבים הוגדרו: תיבת clathrin ו-W-9 התיבה. רצף clathrin תיבת קונצנזוס הוגדר במקור L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 אבל וריאנטים התגלו לאחר מכן 11. ה-W-box תואמת PWxxW את הרצף (כאשר x הוא שאריות).
Sla1p (קטלני סינתטי עם אקטין מחייב חלבון-1) זוהה במקור החלבון אקטין הקשורים הכרחי מבנה נורמלי cytoskeleton אקטין ודינמיקה באתרים endocytic בתאי שמרים 12. Sla1p גם קושר את האות NPFxD מיון endocytic הוא קריטי עבור אנדוציטוזה של מטען הנושאת את האות NPFxD 13,14. לאחרונה, Sla1p הודגם להיקשר clathrin באמצעות מוטיב דומה לתיבת clathrin, LLDLQ, כינה גרסה תיבת clathrin-(VCB), וכן לתפקד מתאם clathrin endocytic 15. בנוסף, Sla1p הפך סמן בשימוש נרחב עבור המעיל endocytic ב לחיות פלואורסצנטי תא מחקרים מיקרוסקופיה 16. כאן אנו משתמשים Sla1p כמודל לתיאור גישות מתאם-clathrin מחקרים אינטראקציה. אנו מתמקדים מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא חי, GST, לנתץ, ושיתוף immunoprecipitation שיטות.
Clathrin מצופה שלפוחית (CCV) להשתתף אנדוציטוזה והובלה של Golgi טרנס רשת endosomes, מסלולים שמורים כי הם בסיסי בביולוגיה של התא האיקריוטים. הגישות המתוארת במאמר זה שיטות מועילים כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים האחראים ליצירת CCV, באינטראקציות בין חלבונים מסוימים מתאם cla…
The authors have nothing to disclose.
DF הוא נתמך על ידי גשרים-NSF המילגה דוקטורט. מיקרוסקופ השתמשו בעבודה זו נתמכת בחלקה על ידי הדמיה מיקרוסקופ רשת תשתית הליבה מענק מקולורדו סטייט. העבודה על מתאמי clathrin במעבדה המחבר הוא נתמך על ידי המז"פ הזנק וקרנות איגוד הלב האמריקני בפרס 09SDG2280525 אל SD
Material | Company |
---|---|
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
protease inhibitor cocktail | Sigma |