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Immunology and Infection

Bioluminescent इमेजिंग बीच योगवाहिता जांच स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया इन्फ्लुएंजा और शिशु चूहे में एक वायरस

doi: 10.3791/2357 Published: April 14, 2011

Summary

एक इन्फ्लूएंजा वायरस के साथ समवर्ती संक्रमण स्पर्शोन्मुख के दौरान आक्रामक न्यूमोकोकल रोग के प्रेरण में फंसा कारकों में से एक है

Abstract

1918 इन्फ्लूएंजा वायरस महामारी है, जो दुनिया भर में लगभग 50 लाख लोग मारे गए थे के दौरान, मौत के बहुमत अकेले इन्फ्लूएंजा वायरस के साथ संक्रमण के परिणाम नहीं थे. इसके बजाय, सबसे अधिक व्यक्तियों के लिए एक माध्यमिक बैक्टीरियल संक्रमण के आगे घुटने टेक दिए है लगा रहे हैं, predominately जीवाणु स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus) की वजह से . इन्फ्लूएंजा वायरस और pneumococcus की वजह से संक्रमण के बीच synergistic संबंध बाद में 1957 एशियाई इन्फ्लूएंजा वायरस महामारी के दौरान देखा गया है, के रूप में अच्छी तरह से वायरस की मौसमी प्रकोप के दौरान (1, 2 में समीक्षा). यहाँ, हम एक (ओं) समवर्ती इन्फ्लूएंजा ए वायरस और एस का एक परिणाम के के रूप में व्यवस्था है कि वृद्धि की रुग्णता में शामिल हो सकता है की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन निमोनिया संक्रमण. हम मज़बूती से एक शिशु murine मॉडल विकसित किया है और reproducibly एस के साथ उपनिवेश चूहों के इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण के प्रभाव का प्रदर्शन निमोनिया. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम सह रखे, नवजात चूहों में vivo इमेजिंग 3 का उपयोग कर के बीच न्यूमोकोकल संचरण के कैनेटीक्स में पहली अंतर्दृष्टि प्रदान की है.

Protocol

1. Bioluminescent एस के संक्रामक स्टॉक की तैयारी निमोनिया

  1. मेकार्टनी 10ml टोड - हेविट 0.5% (w / v) खमीर निकालने और bioluminescent एस के साथ एक रक्त अगर छोटा सा टुकड़ा के साथ पूरक शोरबा युक्त ट्यूब टीका लगाना निमोनिया और 37 में statically बढ़ने डिग्री सेल्सियस 0.40-0.45 ऑप्टिकल घनत्व (600nm).
  2. इस विकास के चरण में कोशिकाओं को गिरफ्तारी के 5 मिनट के लिए गीला बर्फ पर संस्कृति प्लेस.
  3. मध्य लॉग विकास के चरण एस के 10 मिलीलीटर निमोनिया 1 मिलीलीटर के 80% (v / v) ग्लिसरॉल और मिश्रण, वांछित मात्रा में विभाज्य और -70 पर दुकान डिग्री सेल्सियस जोड़ने
  4. Bioluminescent एस की संक्रामक खुराक निर्धारित रक्त अगर प्लेटों पर धारावाहिक dilutions की व्यवहार्य गिनती से निमोनिया शेयर.

2. और एक इन्फ्लूएंजा वायरस शेयर के विकास और तैयार

  1. इन्फ्लुएंजा ए वायरस 10 दिन पुराने embryonated चिकन अंडे की allantoic द्रव में उगाया जाता है.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक इन्फ्लूएंजा वायरस के साथ एक शीशी पहले गला लें.
  3. Airsac (candling), चिह्न, पर रखा अंडा खोल एक अंतर्निहित नसों के मुक्त बिंदु पर हवा की थैली के स्थान पर एक प्रकाश स्रोत का उपयोग.
  4. अंडे की सतह 70% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा शुद्ध करना और साफ साफ.
  5. पियर्स हवा की थैली में एक जौहरी मुंशी का उपयोग निशान से ऊपर सिर्फ एक छोटा सा छेद.
  6. अंडे के साथ हवा की थैली ऊपरवाला के साथ एक दफ़्ती में तैनात, एक 13mm 1ml सिरिंज और एक 26G सुई का उपयोग करने के लिए 0.1mL उचित पतला इन्फ्लूएंजा ए वायरस के साथ प्रत्येक अंडे खोल में छेद के माध्यम से टीका लगाना. Allantoic गुहा में सुई सीधे नीचे की ओर इंगित करें, airsac भेदी.
  7. पिघला मोम के साथ छेद सील और 35 में 2 दिन एक humidified अंडे इनक्यूबेटर में डिग्री सेल्सियस के लिए अंडों को सेते हैं 2 दिन ऊष्मायन मोमबत्ती, अंडे के बाद रक्त वाहिकाओं की उपस्थिति के लिए जाँच करने के लिए की पुष्टि भ्रूण अभी भी जिंदा है. यदि अंडे काले अंदर है, भ्रूण की मृत्यु हो गई है और अंडे त्याग किया जाना चाहिए और एक इन्फ्लूएंजा वायरस की कटाई के लिए इस्तेमाल नहीं किया.
  8. 4 में अंडे रखें डिग्री सेल्सियस रातोंरात भ्रूण को मारने के लिए और रक्त वाहिकाओं कसना आदेश में जहाजों के व्यवधान को कम करने के लिए, रक्त और वायरस के बीच संपर्क के रूप में वायरस के बंधन में लाल रक्त कोशिकाओं के लिए नतीजा होगा.
  9. अगले दिन, 70% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा अंडे की सतह कीटाणुरहित.
  10. एक वर्ग द्वितीय जैवसुरक्षा मंत्रिमंडल में कार्य करने के लिए allantoic इन्फ्लूएंजा अंडे से एक वायरस युक्त तरल पदार्थ इकट्ठा. मोम निकालें और घुमावदार कैंची का उपयोग करने के लिए अंडे के ऊपर चारों ओर कटौती allantoic झिल्ली के ऊपर हवा की थैली हटाने.
  11. पंचर और वापस allantoic बाँझ संदंश का उपयोग झिल्ली छील.
  12. एक 10ml बाँझ विंदुक के साथ allantoic तरल पदार्थ Aspirate जबकि दूसरे बाँझ विंदुक के साथ एक तरफ भ्रूण पकड़े. 50ml ट्यूबों में जमा allantoic तरल पदार्थ ले लीजिए और सभी समय पर बर्फ पर रखने. यदि allantoic द्रव खूनी है या शामिल की जर्दी पूल करने के लिए जोड़ नहीं है.
  13. 5min के लिए कमरे के तापमान पर 2000 rpm के लिए मलबा हटाने पर allantoic तरल पदार्थ अपकेंद्रित्र.
  14. 1-2 मिलीलीटर cryotubes और दुकान में -70 में संक्रामक allantoic द्रव विभाज्य डिग्री सेल्सियस
  15. इन्फ्लूएंजा thawed allantoic तरल पदार्थ की एक 3 स्वतंत्र प्रदर्शन Madin डार्बी कुत्ते गुर्दे की कोशिकाओं (नीचे देखें) में पट्टिका गठन assays में वायरस titre का निर्धारण करते हैं. प्रत्येक प्रयोग के लिए वायरस की एक नई विभाज्य का प्रयोग करें. दोहराया फ्रीज विगलन संक्रामकता titre कम हो जाएगा.

3. Bioluminescent एस के साथ चूहों के intranasal संक्रमण निमोनिया और / या इन्फ्लूएंजा ए वायरस

  1. Bioluminescent एस के पिघलना जमे हुए शेयर निमोनिया और पीबीएस में वांछित खुराक के लिए पतला .
  2. धीरे तर्जनी और अंगूठे के बीच 5 दिन पुराने चूहों लेने और सीधा रखना है. एक विंदुक प्रयोग करें bioluminescent एस ड्रॉप nares पर 3μl की एक मात्रा में निमोनिया. रुको जब तक inoculum के सभी वापस माउस पिंजरे में रखने से पहले साँस है. नकली संक्रमण के लिए पीबीएस के 3μl का प्रयोग करें.
  3. तीन से नौ दिनों bioluminescent एस के साथ उपनिवेशण के बाद निमोनिया, allantoic तरल पदार्थ की एक विभाज्य एक इन्फ्लूएंजा वायरस युक्त पिघलना और पीबीएस में वांछित एकाग्रता के लिए पतला. 3μl पीबीएस की एक मात्रा के रूप में 3.2 कदम पर वर्णित में इन्फ्लूएंजा ए वायरस के साथ चूहों संक्रमित. नकली वायरस के संक्रमण के लिए असंक्रमित अंडे से पतला allantoic तरल पदार्थ के 3μl का प्रयोग करें.
  4. चूहों के कल्याण के दैनिक मॉनिटर उनकी उपस्थिति, व्यवहार, शरीर की स्थिति को देख और चूहों कि ≤ 3 दिन पुराने हैं में, दूध धब्बे की उपस्थिति. मानवीय अंत अंक और हस्तक्षेप मानदंडों के लिए एक गाइड प्रयोगशाला पशु पशुचिकित्सा (3 टेबल) के साथ परामर्श में विकसित किया जाना चाहिए.

4. Bioluminescent इमेजिंग IVIS (कैलिपर लाइफ साइंसेज) के स्पेक्ट्रम का उपयोग

  1. 0.75 मिलीग्राम / एमएल और xylazine 1.76mg/ml में इंजेक्शन पानी में ketamine का एक मिश्रण तैयार करें.
  2. चूहों चतनाशून्य करना, peritoneal में 100μl/10 जी शरीर के वजन इंजेक्षनगुहा.
  3. Anaesthetized चूहों इमेजिंग बॉक्स में रखें. सावधान ध्यान कैमरे के लिए ब्याज समानांतर के संरचनात्मक क्षेत्र रखते हुए जब इमेजिंग बॉक्स / चैम्बर के अंदर माउस रखने भुगतान किया जाना चाहिए.
  4. IVIS में चूहों के साथ प्लेस बॉक्स और बॉक्स में 0.5 एल / मिनट संज्ञाहरण बनाए रखने में isoflurane प्रविष्टि की अनुमति.
  5. IVIS मशीन सेट इमेजिंग मंच और binning सही और 7 मिनट के लिए छवि पर कब्जा.
  6. एक गरम बॉक्स (eg. एक गर्मी पैड का उपयोग कर) में संज्ञाहरण से घर पिंजरे के लिए लौटने से पहले ठीक करने के लिए चूहों की अनुमति दें.
  7. छवियाँ और विश्लेषण ही लिविंग छवि सॉफ्टवेयर पैकेज संस्करण 3.0 (कैलिपर लाइफ साइंसेज) का उपयोग कर पैमाने पर करने के लिए समायोजित कर रहे हैं.
  8. ब्याज की एक चयनित क्षेत्र में bioluminescent संकेतों या तो कुल प्रवाह (फोटान / s) या औसत चमक (फोटॉनों / एस / 2 सेमी / sr) के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है.

5. ऊतकों के प्रसंस्करण के लिए बैक्टीरियल लोड और वायरस टिटर निर्धारित

  1. चूहे सीओ 2 asphyxiation द्वारा euthanased हैं और फर 70% इथेनॉल का उपयोग कीटाणुरहित .
  2. एक कठिन काटने बोर्ड पर पशु स्थिर.
  3. एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, जानवर के सिर के मध्य के माध्यम से कटौती, पीछे शुरू, और सिर के बाहर के प्रत्येक पक्ष झुकने से nasopharynx बेनकाब.
  4. 1.5mL बर्फ ठंड RPMI में बाँझ संदंश और जगह का उपयोग कर सिर के प्रत्येक आधे से ऊतक scraping द्वारा प्रत्येक जानवर के nasopharyngeal ऊतक लीजिए. बर्फ पर रखें.
  5. छाती गुहा का उपयोग कैंची खोलें और बाँझ संदंश और कैंची का उपयोग फेफड़ों को हटा दें. फेफड़ों पीबीएस में तीन बार के लिए किसी भी रक्त निकालने और 1.5mL बर्फ ठंड RPMI में एकत्रित कुल्ला. बर्फ पर रखें.
  6. ऊतकों homogenize homogeniser, बर्फ पर वापस जगह का उपयोग करें.
  7. Homogenized ऊतक के एक विभाज्य निकालें और बैक्टीरियल लोड निर्धारित करने के लिए इस का उपयोग करें. ऊतक homogenate और एचवीए पर थाली के धारावाहिक dilutions तैयार करें. 37 में संस्कृति प्लेटों डिग्री सेल्सियस 18-24 बजे के लिए और व्यवहार्य गिनती निर्धारित. किसी विशेष अंग में बैक्टीरियल titers तो उस क्षेत्र में मनाया फोटॉनों की संख्या के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है.
  8. 4 में 10 मिनट के लिए 3500 rpm पर homogenized ऊतक के बाकी अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला और स्वच्छ, बाँझ ट्यूबों के लिए स्थानांतरण को ले लीजिए. स्टोर सतह पर तैरनेवाला -70 डिग्री सेल्सियस और पट्टिका परख द्वारा वायरल टिटर निर्धारित है.

6. फलक ऊतक homogenates में इन्फ्लूएंजा ए वायरस टिटर निर्धारित परख

  1. वायरस संक्रामकता titers Madin डार्बी कुत्ते गुर्दे की कोशिकाओं (MDCK) का मिला हुआ monolayers पर पट्टिका गठन के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. MDCK कोशिकाओं नियमित RF10 टिशू कल्चर की बोतलें (Nunc) में (1 टेबल) में सभ्य हैं और passaged मिला हुआ जब.
  2. टिशू कल्चर trypsin का उपयोग बोतलों से MDCK कोशिकाओं को अलग. RF10 में कोशिकाओं को धो और 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और RF10 में pelleted कोशिकाओं resuspend. MDCK एक hemocytometer और महत्वपूर्ण डाई का उपयोग कर कक्षों की गणना. 6 अच्छी तरह से प्लेटों के 1.2x10 6 37 RF10 3ml और संस्कृति की कोशिकाओं में MDCK कोशिकाओं के प्रत्येक के साथ अच्छी तरह से 35 मिमी बीज (Nunc) डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 प्राप्त करने के लिए confluency (~ 24 घंटे में ).
  3. लेबोविट्ज़ dsL15 मीडिया और 1.8% (w / v) agarose उपरिशायी मीडिया (1 टेबल) तैयार करें. विभाज्य dsL15 मीडिया और 1.8% (w / v) बाँझ बोतलों में 50ml में agarose. 4 में dsL15 मीडिया रखें ° सी का उपयोग करें और पर agarose 56 डिग्री सेल्सियस तक उपयोग करें जब तक.
  4. जाँच करें कि MDCK सेल monolayers मिला हुआ है और RPMI + के साथ कोशिकाओं धो RF10 aspirating और यह साथ की जगह ~ 1.5ml RPMI +. प्रक्रिया में कोई स्तर पर प्लेटों को पूरी तरह से सूखे की अनुमति दी जाना चाहिए. 37 में प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस तक वायरस युक्त नमूनों को जोड़ने के लिए तैयार है.
  5. RPMI में वायरस के नमूने के धारावाहिक dilutions तैयार +. नमूने उपयोग करें जब तक बर्फ पर रखें.
  6. Aspirate monolayers से + + वायरस के नमूने की उचित dilutions RPMI और एक अच्छी तरह 135uL RPMI जोड़ने. दो प्रतियों में प्रत्येक नमूना टेस्ट.
  7. 37 पर 45 मिनट के लिए वायरस के नमूने के साथ MDCK कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. धीरे प्लेटें हर 15 मिनट के वायरस समान रूप से वितरित और MDCK सेल monolayers के सुखाने को रोकने हिला.
  8. Agarose हटो से 56 ° 46 सी डिग्री सेल्सियस waterbath और 46 से डिग्री सेल्सियस waterbath में गर्म dsL15 मीडिया.
  9. MDCK monolayers पर वायरस के 45min ऊष्मायन के बाद, प्लेटें 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर के बाहर ले जाना . से 46 ° सी waterbath agarose और l15 मीडिया निकालें. 50ml dsL15 मीडिया 0.2mL 0.1% trypsin जोड़ें, की तुलना में 50ml 1.8% (w / v) agarose + dsL15 के trypsin 50ml जोड़ने. Agarose और l15 धीरे मिक्स और 6 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए उपरिशायी माध्यम के 3ml जोड़ने. धीरे पूरे MDCK सेल monolayer सुनिश्चित करने के लिए ज़ुल्फ़ कवर किया जाता है. एक बार में 37 उपरिशायी पर सेते प्लेटें सेट कर दिया जाता है डिग्री सेल्सियस और 5% 2-4 दिनों के लिए सीओ 2 .
  10. ऊष्मायन अवधि के अंत में, वायरस infectivi का एक उपाय के रूप में सजीले टुकड़े की संख्या गिनतीty. यदि आवश्यक हो, सजीले टुकड़े क्रिस्टल मेथनॉल में भंग वायलेट के साथ monolayers के धुंधला द्वारा visualized किया जा सकता है.

7. धारा सी - सफलता के लिए रहस्य:

1 एस के साथ सभी प्रयोगात्मक कार्य निमोनिया (तरल संस्कृतियों के eg. टीका, एस निमोनिया से संक्रमित चूहों से ऊतकों की प्रोसेसिंग) एक वर्ग द्वितीय जैवसुरक्षा मंत्रिमंडल में किया जाता है.

1.1 हम bioluminescent एस बनाने pPJTG28 प्लाज्मिड 3 शुरू करने से निमोनिया उपभेदों. हालांकि, अलग bioluminescent एस की एक विस्तृत विविधता निमोनिया उपभेदों 4-6 उपलब्ध हैं. Bioluminescent एस. निमोनिया उपभेदों कैलिपर लाइफ साइंसेज इंक (MA, संयुक्त राज्य अमरीका) से भी खरीदा जा सकता है है .

1.1 विभिन्न एस के विकास कैनेटीक्स निमोनिया उपभेदों अलग और प्रत्येक तनाव के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए सकता है. यह OD600nm 0.4 = 0.45 तक पहुँचने के बीच 3 से 4 घंटे लग सकता है.

1.4 हम आम तौर पर संक्रामक शेयरों 10e8 CFU / एमएल एकाग्रता तक पहुँचने के लिए और 10E-10E-4 से 8 के लिए एक कमजोर पड़ने रेंज व्यवहार्य जीवाणुओं की एकाग्रता का निर्धारण करने की सिफारिश की उम्मीद है.

2.6 अंडे inoculating के लिए उपयोग करने के लिए उपयुक्त titre, वायरस इस्तेमाल किया तनाव पर निर्भर करता है और 10E-3 से 10E-5 रेंज कर सकते हैं. इन्फ्लुएंजा ए वायरस टिशू कल्चर supernatants से प्राप्त उपभेदों कभी कभी स्वच्छ इस्तेमाल किया जा सकता है.

3.2a हम नियमित 2,000 एस के CFU उपयोग निमोनिया EF3030 तनाव 5 दिन पुराने 3 चूहों उपनिवेश. inoculum की सटीक संक्रामक खुराक retrospectively प्रत्येक प्रयोग के लिए घोड़े रक्त अगर प्लेटों पर inoculum के धारावाहिक dilutions चढ़ाना द्वारा निर्धारित किया जाता है. एस की क्षमता निमोनिया तनाव करने के लिए चूहों उपनिवेश पहले ऊतक homogenates के व्यवहार्य गिनती (eg. nasopharynx, फेफड़ों) चूहों के टीकाकरण के बाद कई बार अंक में से निर्धारित होता है.

3.2b यह anaestetics का उपयोग करने के लिए साँस लेना के माध्यम से पशुओं के लिए बैक्टीरिया या वायरस प्रशासन के लिए आवश्यक नहीं है. शिशु चूहों (के रूप में अच्छी तरह से वयस्क चूहे के रूप में) हाथ से रोका जाना चाहिए और ईमानदार अन्वेषक द्वारा आयोजित, inoculum (शिशु चूहों के लिए 3 microliter, वयस्क चूहों के लिए 10 microliter) तो nares और साँस लेना पर गिरा दिया है inoculum के सभी अवलोकन द्वारा की पुष्टि की है.

3.2c नवजात चूहों एक घोंसला और बैक्टीरिया या वायरस के रूप में की जरूरत के साथ टीका लगाना से निकालें. मार्क जानवर की पूंछ एक स्थायी मार्कर का उपयोग कर यदि आवश्यक और वापसी जानवर पिंजरे में वापस तुरंत. कुछ सामग्री बिस्तर के साथ पशु रगड़ो इतना है कि बांध पिल्ले घोंसले में वापस स्वीकार करेंगे. नोट: स्थायी मार्कर बंद की मालिश जानवरों को जल्दी और करने के लिए दैनिक लागू की जरूरत है. वैकल्पिक रूप से, एक टैटू प्रणाली के लिए अलग - अलग जानवरों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

3.3 हम 20 Pfu एक वायरस Udorn/307/72 इन्फ्लूएंजा (H3N2) का उपयोग करने के लिए 8 से 14 दिन पुरानी चूहों 3 संक्रमित. मृत्यु दर और रुग्णता पशुओं में मनाया एस के तनाव पर निर्भर करेगा निमोनिया और इन्फ्लूएंजा ए वायरस का इस्तेमाल किया. तालिका 3 मानवीय अंत अंक और हस्तक्षेप करने के लिए उम्र के 21 दिनों की तुलना में युवा चूहों में उपयोग करने के लिए मापदंड का एक उपयोगी सेट प्रदान करता है. हम आम तौर पर किसी भी मृत्यु दर या रुग्णता का पता नहीं लगा जब एस का उपयोग करना निमोनिया EF3030 और एक वायरस तनाव Udorn/307/72 इन्फ्लूएंजा (H3N2) जब चूहों> 10 दिन पुराने हैं.

4.2 करने के लिए सही हो, चूहों संवेदनाहारी समाधान के इंजेक्शन से पहले तौला जा सकता है. एक गाइड के रूप में, संवेदनाहारी समाधान के बारे में 50-75 microliters 20 दिन पुरानी चूहों के लिए प्रयोग किया जाता है. माउस को पूरी तरह anesthetized है पूंछ या हिंद अंग में जब एक चुटकी के जवाब नहीं. जबकि IVIS में, चूहे भी isoflurane जो संज्ञाहरण जोड़ना होगा उजागर किया जाएगा. चूहों के संक्रमण के बाद इमेजिंग के समय एस के तनाव (ओं) पर निर्भर करता है निमोनिया और इन्फ्लूएंजा ए वायरस के हित के लक्षणों पर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया. कुछ पायलट प्रयोगों प्रदर्शन bioluminescent इमेजिंग के समय का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

4.3 चूहे या तो एक अलग बॉक्स (जो बॉक्स में प्रवेश करने या बाहर निकलने से रोकता है contaminants के) में रखा जा सकता है या वैकल्पिक रूप से, इमेजिंग के लिए साधन में सीधे रखा जा सकता है. हम शिशु चूहों के साथ प्रयोग के लिए अलगाव बॉक्स का उपयोग करें, क्रम में यह सुनिश्चित करने के लिए चूहों इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान anaesthetized रहते हैं और एस के साथ IVIS के प्रदूषण को रोकने के निमोनिया और / या एक वायरस इन्फ्लूएंजा.

4.3 श्वसन तंत्र की एक छवि प्राप्त चूहों के एक उदर छवि का प्रयोग करें. माउस के एक पार्श्व छवि कान का एक और अधिक संवेदनशील छवि प्रदान करता है.

4.4 जब चूहों को सीधे कक्ष में रखा जाता है, नाक शंकु के माध्यम से चूहों को isoflurane दिया है. प्रयोगों में जो शिशु चूहों का इस्तेमाल कर रहे हैं के लिए है, अलगाव बॉक्स के बाद से शिशु चूहों पर नाक शंकु फिट नहीं पसंद है.

4.5 टीवह कुल निवेश एक छवि पर कब्जा करने की जरूरत समय के प्रयोगों के बीच bioluminescent संकेत की ताकत के अनुसार भिन्न, संकेत, बैक्टीरियल तनाव के स्थान सकते हैं और माउस तनाव का इस्तेमाल किया. बाद के बारे में, दोनों वर्णक और फर काफी कुल detectable संकेत attenuate कर सकते हैं. IVIS स्पेक्ट्रम पर कैमरा है एक वापस thinned है, वापस प्रबुद्ध सीसीडी की पेशकश की एक व्यापक गतिशील रेंज (65,536 ग्रे स्तर). आदर्श रूप में, जोखिम समय 60 के बीच और 60,000 मायने रखता है पर कब्जा करने के लिए सेट किया जाना चाहिए. C57BL / 6 चूहों के साथ हमारे अनुभव, 7 मिनट से परे इमेजिंग समय बढ़ाने में स्पष्ट रूप से शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार नहीं करता है. Bioluminescent संकेत बढ़ाने के लिए वैकल्पिक विकल्प binning की डिग्री (ie. बड़े) में वृद्धि शामिल हैं और देखने के एक छोटे क्षेत्र का उपयोग कर. महत्वपूर्ण बात है, मात्रा का ठहराव संतृप्त पिक्सल वाले छवि के अंदर क्षेत्रों पर प्रदर्शन नहीं करना चाहिए, के रूप में यह पता चला फोटॉनों की संख्या के लिए एक मूल्य को कम करके आंका प्रदान करता है. यदि इष्टतम स्थितियों के रूप में अनिश्चित है, ऑटो जोखिम सुविधा एक दिशानिर्देश के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

4.5 यदि माउस के एक भाग में एक मजबूत bioluminescent संकेत पास के एक क्षेत्र में bioluminescence का पता लगाने में बाधा डालने, माउस के चयनित क्षेत्रों काले कागज और इमेजिंग के साथ कवर किया जा सकता है सामान्य रूप में आगे बढ़ सकते हैं

4.7 यदि luminescent संकेत फोटॉनों (के रूप में गिनती के लिए विरोध) इमेजिंग परिस्थितियों में (जैसे इमेजिंग समय) प्रयोगों के बीच भिन्नरूपों bioluminescent संकेत के माप को प्रभावित नहीं करेगा में मात्रा निर्धारित है.

4.8 यदि एक निर्दिष्ट क्षेत्र में फोटॉनों को मापने के लिए कुल प्रवाह का उपयोग सुनिश्चित करें कि 'एक ही आकार हित के क्षेत्र के सभी नमूनों के लिए प्रयोग किया जाता है.

5.1a चूहे एक इन्फ्लूएंजा वायरस के साथ किसी भी समय बिंदु पर संक्रमण के बाद euthanized किया जा सकता है है, शोधकर्ता के हित पर निर्भर करता है. आम तौर पर हम एक इन्फ्लूएंजा वायरस Udorn/307/72 (H3N2) के साथ संक्रमण के बाद 6 दिनों में बैक्टीरियल और वायरल titre और निर्धारित किसी भी मृत्यु दर / रुग्णता का पालन नहीं है. हालांकि, इन प्रयोगों में मनाया रुग्णता और मृत्यु दर S.pneumoniae के आधार पर भिन्न और इन्फ्लूएंजा वायरस तनाव का इस्तेमाल किया जाएगा और समय chosed बिंदु खाते में मृत्यु दर और रुग्णता की दर लेने के लिए पशु कल्याण पर प्रभाव को कम करना चाहिए. तालिका 3 इन प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए एक हस्तक्षेप के मानदंड और मानवीय endpoints के लिए उपयोगी मार्गदर्शन प्रदान करता है. आम तौर पर, चूहों euthanized ऊतक और प्रसंस्कृत रूप में vivo bioluminescent इमेजिंग के बाद 3 घंटे के भीतर वर्णित हैं.

5.1b 10 दिनों की तुलना में छोटी पुराने चूहे hypoxia के लिए प्रतिरोधी रहे हैं और कत्ल द्वारा euthanized हैं. वर्णित प्रयोगात्मक सेटअप में, चूहों कम से कम 14 दिन पुराने हैं और सीओ 2 asphyxiation द्वारा euthanized हो सकता है.

5.7 रक्त अगर प्लेटें 5μg/ml gentamicin साथ पूरक हो सकता है नाक के ऊतकों के homogenates में खानेवाला जीवाणुओं की वृद्धि को रोकने के लिए. इस्तेमाल किया dilutions की रेंज एस पर निर्भर करेगा निमोनिया तनाव इस्तेमाल किया. एस के साथ 20 दिन पुरानी चूहों में प्रयोगों के लिए निमोनिया EF3030 तनाव, हम साफ, 10E 1, 10E-2 और 10E-3 का उपयोग करें.

5.8 homogenized ऊतक के कम से कम दो aliquots में प्रत्येक नमूना, स्टोर इतना है कि एक बैकअप नमूना उपलब्ध मामले में वायरस पट्टिका परख विफल रहता है! एक सटीक वायरल टिटर केवल एक नमूना ठंड नहीं बल्कि नमूनों से फ्रीज बार बार thawed के बाद एक बार thawed से प्राप्त किया जा सकता है.

6.1 जब 90-100% मिला हुआ हो, एक एकल 150cm 2 टिशू कल्चर फ्लास्क पाँच 6 अच्छी तरह प्लेटों के लिए पर्याप्त MDCK कोशिकाओं निकलेगा.

6.5 इष्टतम धारावाहिक कमजोर पड़ने वायरस इस्तेमाल किया तनाव और संक्रमण के बाद समय पर निर्भर करेगा. आमतौर पर, हम homogenates अंग 6 दिनों एक इन्फ्लूएंजा वायरस के साथ संक्रमण के बाद लिया के लिए स्वच्छ, 10E-1 और 10E-2 dilutions का प्रयोग करेंगे.

6.6 वायरस शेयर के धारावाहिक dilutions के इस्तेमाल प्रत्येक पट्टिका परख में एक उचित उपयोग के लिए सकारात्मक नियंत्रण है. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, RPMI + इस्तेमाल किया जा सकता है.

8. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1
चित्रा 1 embryonated चिकन अंडे के योजनाबद्ध आरेख.

2 चित्रा गुम
चित्रा 2 एस के BLI. निमोनिया पर इन्फ्लूएंजा वायरस के साथ नकली संक्रमण के बाद 3 दिन और 4 दिन माउस संक्रमित.

चित्रा 3
चित्रा 3 एस के BLI. 3 दिन और इन्फ्लूएंजा वायरस के साथ संक्रमण के बाद 4 दिन पर निमोनिया और इन्फ्लूएंजा वायरस के सह - संक्रमित माउस .

चित्रा 4
चित्रा 4 एकल नाक में बैक्टीरियल लोड और एक सह - infec.टेड माउस.

चित्रा 5
5 चित्रा एक सह - संक्रमित माउस के नाक और फेफड़ों में वायरल titres.

मीडिया सामग्री
1.8% (w / v) agarose 50ml आसुत एच 2 हे agarose के 0.9 ग्राम जोड़ें 10min के लिए 121 ° सी में autoclaving बाँझ. 56 डिग्री सेल्सियस waterbath शांत करने के लिए स्थानांतरण.
डबल ताकत लेबोविट्ज़ l15 मध्यम (l15 डी एस) L15 पाउडर (1L बनाने के) के एक झोला 450 एमएल बाँझ आसुत एच 2 हे में भंग कर रहा है और जब तक भंग हड़कंप मच गया. पीएच 1M एचसीएल के साथ 6.8 पीएच को समायोजित है. फिर 4mL 7 (w / v) NaHCO3%, 0.4mL HEPES (0.5m, 6.8 पीएच), 200 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन 200 / μg मिलीलीटर, 60 μg / मिलीलीटर gentamicin साथ पूरक. 500ml और फिल्टर बाँझ अंतिम मात्रा समायोजित करें.
हार्स रक्त अग्रवाल (एचवीए) 4% एचवीए (Oxoid, बेसिंगस्टोक, ब्रिटेन), DH 2 हे, 7% (v / v) हार्स रक्त
RF10 RPMI-1640, 2nM सोडियम पाइरूवेट 2mm glutamine, 24 μg / एमएल gentamicin, 100 / यू मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% (v / v) गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम युक्त.
RPMI + RPMI-1640, 2nM सोडियम पाइरूवेट 2mm glutamine, 24 μg / एमएल gentamicin, 100 / यू मिलीलीटर पेनिसिलिन, युक्त 100 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन
टोड हेविट शोरबा + 0.5% खमीर निकालने (Oxoid, बेसिंगस्टोक, ब्रिटेन) में टोड हेविट DH 2 हे शोरबा 2 (w / v)% खमीर निकालने के साथ पूरक

तालिका 1 विशिष्ट मीडिया इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया.

सामग्री नाम टाइप कंपनी सूचीपत्र संख्या टिप्पणी
RPMI 1640 मध्यम अभिकर्मक Gibco 21870-076
Trypsin अभिकर्मक Worthington बायोकेमिकल निगम LS003740 TPCK इलाज
लेबोविट्ज़ मध्यम L-15 अभिकर्मक Gibco 41300-039
Agarose, मैं लिखें अभिकर्मक सिग्मा Aldrich A6013 SeaPlaque agarose के रूप में कम पिघलने तापमान agarose, का उपयोग करें
Madin - डार्बी कुत्ते गुर्दे की कोशिकाओं अभिकर्मक ATCC सीसीएल - 34

तालिका 2 विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों.

पशु कल्याण पर प्रभाव
मॉडरेट संकेत करने के लिए हल्के गंभीर संकेत
गैर विशिष्ट चिह्न (ओं):
दिखावट कोई निर्जलीकरण (त्वचा tenting) के साथ piloerection उदारवादी थोड़ा सा निर्जलीकरण के साथ Piloerection (त्वचा tenting)
शारीरिक हालत वजन कम नहीं वजन या वजन में कमी
बिहेवियर मातहत लेकिन उत्तरदायी, साथियों के साथ बातचीत की कमी हुई. अप्रतिसादी गतिविधि और उकसाव. अन्य littermates से पृथक
विशिष्ट शर्तों या असामान्य नैदानिक ​​चिह्न (ओं):
दूध मौके की अनुपस्थिति
(<2-3 दिन पुरानी)
दूध पिलाती है अगर इस 24 घंटों <के लिए मनाया गया है को प्रोत्साहित करने की कोशिश करो. यदि 24-48h के बाद प्रोत्साहन के साथ भी दूध के स्थान का कोई सबूत नहीं है, या यदि जाहिर suckled नहीं है, इच्छामृत्यु पर विचार.
अन्य लक्षण पशु सुविधा पशु / प्रबंधक प्रयोगशाला पशुचिकित्सा सलाह पुनः शोध: उचित कार्रवाई या euthanise अगर जानवर उदारवादी या गंभीर दर्द या संकट में है

तालिका 3. शिशु चूहों (<21 दिन पुरानी) के लिए हस्तक्षेप मानदंड:

जब एक या एक से अधिक हल्के उदारवादी 'संकेत से मनाया जाता है दो बार दैनिक टिप्पणियों की आवृत्ति में वृद्धि और जहां उचित ताकि उपचार और ध्यान दिया जा सकता है पशु कल्याण अधिकारी से सलाह लेनी.

b जब एक या एक से अधिक 'गंभीर' संकेत मनाया जाता है, का उपयोग चूहों euthaniseउपयुक्त विधि. चूहे <10 दिन पुराने कत्ल के द्वारा euthanized हैं, चूहों> 10 दिनों के पुराने सीओ 2 asphyxiation द्वारा euthanized हैं .

Discussion

Vivo में IVIS मशीन के साथ इमेजिंग एक अनोखी पद्धति है कि माइक्रोबियल रोगजनन 4, 6-9 के वास्तविक समय दृश्य की अनुमति देता है. यहाँ, हम एस के बीच योगवाहिता को समझने के लिए इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग शो शिशु चूहों में निमोनिया और इन्फ्लूएंजा वायरस. इस तकनीक का गैर इनवेसिव प्रकृति के कारण, हम समय पर प्रत्येक व्यक्ति माउस में संक्रमण की प्रगति की निगरानी करने में सक्षम किया गया है. यह हमारे सह रखे शिशु 3 चूहों के बीच न्यूमोकोकल संचरण के कैनेटीक्स दस्तावेज़ सक्षम है . इस तकनीक की प्रकृति गैर इनवेसिव शोधकर्ताओं प्रयोग प्रति कम जानवरों का उपयोग करने के लिए सक्षम बनाता है और इसलिए जानवर के उपयोग को कम. यह भी संभव है IVIS मशीन का उपयोग संक्रमण के शरीर में पहले से अज्ञात साइटों के लिए संक्रमण के प्रसार की कल्पना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विच्छेदन (जैसे मध्य कान) द्वारा आसानी से नहीं नमूना साइटों.

इमेजिंग प्रयोगों शुरू करने से पहले, हम पुष्टि की है कि bioluminescent EF3030 तनाव की उपनिवेशण स्तर ऊतक homogenates में व्यवहार्य गिनती गणना करके माता पिता EF3030 तनाव के उपनिवेशण स्तर के बराबर थे. इसके अलावा, हम पहले की पुष्टि इन्फ्लूएंजा वायरस से संक्रमण के nasopharynx में bioluminescent EF3030 की वृद्धि लोड में परिणामस्वरूप है कि जानवरों के उपनिवेश के रूप में माता पिता तनाव EF3030 (नहीं दिखाया परिणाम है) के साथ प्रदर्शन.

जबकि IVIS प्रौद्योगिकी आसान काम है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और आसान करने के लिए डेटा को समझने उत्पन्न, प्रयोगों को ध्यान से इस तरह डिजाइन करना चाहिए कि संवेदनशीलता और प्रौद्योगिकी के उपयोगिता maximized है. उदाहरण के लिए, IVIS कैमरे की संवेदनशीलता की गहराई और 8 ऊतक, जो हमारे अनुभव में, bioluminescent फेफड़ों से प्रारंभिक संकेतों के लिए सीमा का पता लगाने बढ़ जाती है की अस्पष्टता से प्रभावित है. इसके अलावा, काले फर और pigmented त्वचा के रूप में ज्यादा के 10 गुना के रूप में (गंजा चूहों की तुलना में) 8 प्रकाश संचरण को कम कर देता है. हालांकि इस पद्धति का विकास, हम 5 से 14 दिन पुराने C57BL 6 / चूहों के साथ प्रयोग के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलित है और बाद में दिखा दिया है कि IVIS bioluminescent एस के साथ 20 दिन पुरानी C57BL / 6 चूहों की उपनिवेशण का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है EF3030 निमोनिया. हालांकि, संकेत का पता लगाने जब इन प्रयोगों नग्न या BALB ग / चूहों में प्रदर्शन कर रहे हैं वृद्धि हो सकती है. फिर भी, IVIS कैमरे को मॉनिटर, विशेषताएँ, और अंततः एक इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण निम्नलिखित न्यूमोकोकल रोग के vivo विकास को समझने में एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है.

Disclosures

इस वीडियो लेख के उत्पादन कैलिपर लाइफ साइंसेज द्वारा प्रायोजित किया गया था.

Acknowledgments

लेखकों के लिए स्वीकार करते हैं तकनीकी डेविड Briles (बर्मिंघम, अल, संयुक्त राज्य अमेरिका में अलबामा के विश्वविद्यालय) से सलाह करना चाहते हैं. हम पशु कल्याण के विषय में उपयोगी सुझाव और विचार विमर्श और नैतिकता वर्णित प्रयोगों के लिए और हस्तक्षेप के मानदंड और मानवीय अंत अंक के विकास के लिए Yvette चेन, मेलबोर्न विश्वविद्यालय के पशु कल्याण अधिकारी, और पशु सुविधा प्रबंधक, डेविड टेलर, शुक्रिया अदा करना चाहूँगा इस पांडुलिपि में.

Odilia Wijburg और पैट्रिक पढ़ना एक NHMRC आरडी राइट फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं, Kirsty लघु जीएसके स्नातकोत्तर सहायता अनुदान और एक Puzey छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है.

References

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Short, K. R., Diavatopoulos, D. A., Reading, P. C., Brown, L. E., Rogers, K. L., Strugnell, R. A., Wijburg, O. L. Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice. J. Vis. Exp. (50), e2357, doi:10.3791/2357 (2011).More

Short, K. R., Diavatopoulos, D. A., Reading, P. C., Brown, L. E., Rogers, K. L., Strugnell, R. A., Wijburg, O. L. Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice. J. Vis. Exp. (50), e2357, doi:10.3791/2357 (2011).

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