Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

Summary

Influenza A virusu ile aynı anda enfeksiyon asemptomatik sırasında invazif pnömokok hastalığına indüksiyonu karıştığı faktörlerden biridir

Abstract

, Dünya çapında yaklaşık 50 milyon kişi öldürüldü 1918 grip virüsü salgını, sırasında, ölümlerin büyük çoğunluğu, grip virüsü yalnız ile enfeksiyon sonucu değildi. Bunun yerine, en bireyler, ağırlıklı olarak, bakterinin Streptococcus pneumoniae (pnömokok) yol açtığı ikincil bir bakteriyel enfeksiyon yenik düştüğü düşünülmektedir . , Grip virüsü ve pnömokok yol açtığı enfeksiyonlar arasında sinerjik bir ilişki ^{daha sonra (1,} 2 gözden) yanı sıra virüs mevsimsel salgınlar sırasında, 1957, Asya influenza virüsü pandemisi sırasında gözlenen olmuştur. Burada, biz (ler), eş zamanlı influenza A virüsü ve S. bir sonucu olarak artmış morbidite ile ilgili olabilecek mekanizması araştırmak için kullanılan bir protokol tarif pneumoniae. Biz güvenilir bir bebek fare modeli geliştirdi ve tekrarlanabilir S. ile kolonize farelerin grip virüsü enfeksiyonu etkilerini göstermek pneumoniae. Bu protokolü kullanarak, in vivo görüntüleme ³ ile ortak ev sahipliği, yenidoğan farelerin arasında pnömokok iletim kinetiği ilk içgörü sağladı.

Protocol

1. Bioluminescent S. Enfeksiyöz Stok hazırlanması pneumoniae

1. % 0.5 'lik (w / v) maya özü ve bioluminescent S ile kan agar küçük bir parça ile desteklenmiş 10ml Todd-Hewitt suyu içeren bir McCartney tüp İnokülasyon pneumoniae ve 37 ° statik büyümeye ° C 0,40-0,45 optik yoğunluk (600Nm).
2. Bu büyüme evresi hücrelerin tutuklama, 5 dakika ıslak buz üzerinde kültür yerleştirin.
3. Orta-log büyüme aşamasında S. 10 ml pneumoniae 1 ml (v / v)% 80 gliserol ve karışımı, istenilen birimlere kısım ve mağaza -70 ° C
4. Bioluminescent S. bulaşıcı dozunu saptamak kan agar plaklarına seri dilüsyonları canlı sayımı pneumoniae stok.

2. Büyüme ve influenza A virüs stokunun Hazırlık

1. İnfluenza A virüsü, 10 günlük embriyolu tavuk yumurtası allantoik sıvı içinde yetiştirilir.
2. 37 ° C su banyosu içinde influenza A virüsü ile bir şişe çözülme.
3. Yumurta kabuğu hava kesesi yatan damarlar ücretsiz bir noktada yerini airsac (candling), işareti üzerine yerleştirilen bir ışık kaynağı kullanma.
4. % 70 etanol ile silerek yumurta yüzeyi dezenfekte edin ve silin.
5. Pierce, sadece bir kuyumcuya katip kullanarak işareti üzerine hava kesesi küçük bir delik.
6. Hava kesesi üst ile bir karton yumurta yerleştirilmiş, uygun seyreltilmiş influenza A virüsünün 0.1ml ile her bir yumurta kabuğunda delikten aşılamak için 13mm 1 ml şırınga ve 26g iğne kullanın. Airsac piercing allantoik boşluğuna iğne doğrudan aşağıya gelin.
7. Eritilmiş balmumu ile delik Seal ve yumurta nemlendirilmiş bir kuluçka 2 gün 35 ° C inkübe , 2 gün inkübasyon, mum sonra yumurtaların embriyo hala hayatta olduğunu onaylamak için kan damarlarının varlığını kontrol etmek için. Yumurta içinde siyah ise, embriyo öldü ve yumurta atılmalıdır ve influenza A virüsünün hasat için kullanılmaz.
8. 4 yumurta yerleştirin ° C embriyoların öldürmek ve kan ve virüs arasındaki temas, kırmızı kan hücreleri virüs bağlayıcı neden olduğu gibi, gemilerin bozulması en aza indirmek için kan damarları büzülür gecede.
9. Ertesi gün,% 70 etanol ile silerek yumurta yüzeyi dezenfekte edin.
10. Allantoik sıvı influenza A virüsü içeren yumurta toplamak için bir sınıf II Biyogüvenlik Kabini çalışın. Balmumu çıkarın ve yumurtanın etrafında allantoik membranından yukarıdaki hava kesesi kaldırmak için kesmek için kavisli makas kullanın.
11. Delinme ve geri soyma steril forseps kullanarak allantoik membranından.
12. Embriyonun, başka bir steril pipet ile bir tarafa tutarak 10ml steril bir pipet yardımıyla allantoik sıvı aspire. 50ml tüpler toplanmış allantoik sıvı toplayın ve her zaman buz üzerinde tutmak. Allantoik sıvı kanlı veya içeriyorsa sarısı havuza ilave etmeyiniz.
13. Enkaz kaldırmak için oda sıcaklığında 2.000 devirde 5dk için allantoik sıvı santrifüjleyin.
14. -70 1-2 ml cryotubes ve mağaza kısım bulaşıcı allantoik sıvı ° C
15. Influenza A virüs titresi Madin-Darby köpek böbrek hücreleri (aşağıya bakın) (3) bağımsız olarak plak oluşturan deneyleri çözülmüş allantoik sıvı belirleyin. Her deneme için yeni bir virüs kısım kullanın. Tekrarlanan donma-çözülme enfektivite titresi azaltacaktır.

3. Bioluminescent S. ile farelerin intranazal enfeksiyonu pneumoniae ve / veya influenza A virüsünün

1. Bioluminescent S. çözülme dondurulmuş stok pneumoniae ve PBS istenen doz seyreltilmiş.
2. Yavaşça parmağı ve baş parmak arasında 5 günlük farelerden pick up ve dik tutun. Bioluminescent S. açılan bir pipet kullanın 3μl hacmi burun üzerine pneumoniae. Inokulum kafesine geri fare yerleştirmeden önce inhale kadar bekleyin. PBS sahte enfeksiyon 3μl kullanın.
3. Bioluminescent S. ile kolonizasyon üç ila dokuz gün sonra pneumoniae, influenza A virüsünün allantoik sıvı içeren bir kısım Çözülme ve istenilen konsantrasyonu PBS içinde sulandırmak. Adım 3.2 olarak açıklanan 3μl PBS bir ses influenza A virüsü ile enfekte fareler. Mock-virüs enfeksiyonu enfekte olmamış yumurta seyreltilmiş allantoik sıvı 3μl kullanın.
4. Günlük süt noktaların varlığı, ≤ 3 gün eski farelerde, görünüm, davranış, beden durumu gözlemleme ve farelerin refah izleyin. Laboratuar Hayvan Veteriner (Tablo 3) ile istişare halinde geliştirilmiştir insani bitiş noktaları ve müdahale kriterleri için bir rehber olmalıdır.

4. Bioluminescent görüntüleme IVIS Spektrum (Kaliper Yaşam Bilimleri)

1. Enjeksiyonluk su, 0.75 mg / ml ve ksilizin 1.76mg/ml ketamin bir karışım hazırlayın.
2. Fareler uyuşturan, periton içine enjekte 100μl/10 g vücut ağırlığıkavite.
3. Anestezi fareler görüntü kutuya koyun. Dikkat kamera görüntüleme kutusu / odasının farenin içine yerleştirerek faiz paralel anatomik bölgede tutmak için dikkat edilmelidir.
4. IVIS farelerin kutu yerleştirin ve anesteziyi idame ettirmek için 0,5 L / dak kutuya izofluran girişine izin.
5. Görüntüleme platformu ve binning doğru ve 7 dakika görüntü yakalamak için IVIS makine ayarlayın.
6. Fareler, eve kafesi dönmeden önce ısıtılmış bir kutu (örn. ısı takımını kullanarak) anestezi kurtarmak için izin verin.
7. Görüntü analiz ve Yaşayan Image yazılım paketi sürüm 3.0 (Kaliper Yaşam Bilimleri) kullanarak aynı ölçekte ayarlanır.
8. Seçilen bir bölgede ilgi Bioluminescent sinyaller ya toplam akı (foton / s) ya da ortalama parlaklığı (fotonlar / s / cm ² / sr) olarak belirlenebilir.

5. Bakteri yükü ve virüs titresi belirlemek için dokuların işlenmesi

1. Fare, _CO 2 boğulma tarafından itlaf ve% 70 etanol kullanılarak dezenfekte kürk .
2. Sert bir kesme tahtası üzerinde hayvanın hareketsiz.
3. Steril bir neşter bıçak kullanarak, arka başlangıç, hayvanın başının ortasından kesilmiş, ve her iki tarafında baş dışa bükerek nazofarenks maruz.
4. 1.5mL buz soğuk RPMI steril forseps ve yer kullanarak başın her yarım doku kazıma her hayvan nazofarengeal doku toplayın. Buz üzerinde tutun.
5. Makas kullanarak göğüs boşluğuna kadar açın ve steril forseps ve makas kullanılarak akciğerleri kaldırmak. Akciğerler, herhangi bir kan çıkarmak ve 1.5mL buz soğuk RPMI toplamak için PBS içinde üç kez durulayın. Buz üzerinde tutun.
6. Dokular homojenize bir Homojenizatörler geri buz üzerinde yeri kullanın.
7. Homojenize doku bir kısım çıkarın ve bakteri yükü belirlemek için bu kullanabilirsiniz. Doku Homojenat HBA levha ve seri dilüsyonları hazırlayın. Kültür plakalar 37 ° ° C'de 18-24 saat ve yaşayabilir sayısını belirlemek. Belli bir organ bakteriyel titreleri daha sonra bu bölgede gözlenen fotonların sayısı ile ilişkili olabilir.
8. 3500 devirde 10 dakika süreyle homojenize doku geri kalanı Santrifüj 4 ° C Temiz, steril tüpler süpernatantı ve transfer toplayın. Mağaza süpernatant -70 ° C ve viral titresi plak yöntemi ile belirlenir.

6. Plak doku homojenatlarında influenza A virüs titresi belirlemek için tahlil

1. Virüs enfektivite titreleri Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) hücreleri konfluent mono tabakaları üzerinde plak oluşumu ile belirlenir. MDCK hücreleri rutin doku kültürü şişeleri (Nunc) (Tablo 1) RF10 kültürlü ve zaman konfluent geçişli.
2. Tripsin kullanılarak doku kültürü şişeleri MDCK hücreleri ayırın. RF10 hücrelerin yıkayın ve 5 dakika boyunca 1200 rpm'de santrifüj hücreleri toplamak. Süpernatantı atın ve RF10 pelet hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Hemasitometre ve hayati boya kullanarak MDCK hücreleri saymak. 6-kuyucuğu 37 3ml RF10 ve kültür hücreleri 1.2x10 ⁶ MDCK hücreleri ile de her 35mm Tohum (Nunc) (~ 24 saat içinde) confluency ulaşmak için ° C ve% 5 CO _2.
3. Leibovitz dsL15 medya ve% 1.8 'lik (w / v) agaroz bindirme medya (Tablo 1) hazırlayın. Kısım dsL15 medya ve steril şişe 50ml% 1,8 (w / v) agaroz. 4 dsL15 medya tutun ° C kullanım ve agaroz 56 ° C kadar kullanana kadar.
4. MDCK hücre mono tabakaları konfluent olup olmadığını kontrol edin ve hücreleri RF10 aspire ve yerine RPMI + ile yıkayın ~ 1.5ml RPMI. Yordamı herhangi bir aşamada plakaları tamamen kurumasına izin verilmelidir. Plakalar 37 ° ° C'de virüs içeren örnekler eklemek için hazır olana kadar.
5. RPMI virüs örneklerinin seri dilüsyonları hazırlayın +. Örnekleri, kullanılıncaya kadar buz üzerinde tutun.
6. Aspire mono tabakaları RPMI + + virüs örnek uygun dilüsyonları her kuyu 135uL RPMI ekleyin. Nüsha halinde her bir numune test edin.
7. 37 45 dakika süreyle virüs örnekleri ile MDCK hücreleri ° C ve% 5 CO ₂ inkübe edin. Yavaşça plakalar eşit virüs dağıtmak ve MDCK hücre mono tabakaları kurumasını önlemek için her 15 dakikada bir sallayın.
8. 56 agaroz Taşı ° C - 46 ° C su banyosunda 46 ° C su banyosunda sıcak dsL15 medya.
9. MDCK mono tabakaları üzerinde virüs 45dakika inkübasyondan sonra,% 5 CO ₂ inkübatör tabak alır. 46 ° C su banyosunda agaroz ve L15 medya çıkarın. 50ml 1.8% (w / v) agaroz dsL15 50ml + tripsin daha dsL15 medya 50ml% 0.1 tripsin 0.2mL ekleyin. Agaroz ve L15 hafifçe karıştırın ve 6-kuyucuğu her iyi bindirme orta 3ml ekleyin. Yavaşça girdap tüm MDCK hücre tek tabaka sağlamak için kaplıdır. Bindirme kez inkübe plakaları 37 ° C ve% 5 CO ₂ 2-4 gün için.
10. Kuluçka dönemi sonunda, virüs infectivi bir önlem olarak plakların sayısınıty. Gerekirse, plaklar, mono tabakaları metanol içinde çözünmüş kristal viyole ile boyama tarafından görüntülenmiştir.

7. Bölüm C - Başarının Sırları:

S. ile tüm deneysel çalışmalar 1 pneumoniae (örn. aşılama, sıvı kültürlerin S. pneumoniae ile enfekte farelerden alınan doku işleme), bir sınıf II Biyogüvenlik Kabini yapılır .

1.1 bioluminescent S. oluşturmak plazmid pPJTG28 ³ tanıtan pneumoniae. Ancak farklı bioluminescent S., geniş bir yelpazede pneumoniae 4-6 mevcuttur. Bioluminescent S. pneumoniae de kaliper Life Sciences Inc (MA, ABD) satın alınabilir.

Çeşitli S. 1.1 Büyüme kinetiği pneumoniae farklı olabilir ve her bir suş için tespit edilmelidir. = 0.4 0.45 OD600nm ulaşmak için 4-3 saat sürebilir.

1.4 Biz normalde bulaşıcı stokları 108 cfu arası / ml konsantrasyonuna ulaşmak ve 10e-8 10e-4 canlı bakteri konsantrasyonunu belirlemek için bir seyreltme aralığı tavsiye beklersiniz.

2.6 yumurta aşılamak için kullanmak için uygun titresi kullanılan virüs suşu bağlıdır ve 10e-3 10e-5 değişebilir. Doku kültürü süpernatantlar elde edilen Influenza A virüs suşları bazen düzgün kullanılıyor olabilir.

3.2A Biz rutin S. 2.000 CFU pneumoniae suşu EF3030 5 günlük fareler ³ kolonize. Inokulum kesin bulaşıcı doz at kan agar plaklarına inokulum seri dilüsyonları kaplama ile her bir deney için geriye dönük olarak belirlenir. S. yeteneği fareler kolonize pneumoniae suşu ilk farelerin aşılama sonra çeşitli zaman noktalarında doku homojenatlarında canlı sayımı (örn. nazofarenks, akciğerler) tarafından belirlenir.

3.2b anaestetics, bakteri ya da virüs inhalasyon yolu ile hayvanların yönetmek için kullanmak gerekli değildir. Bebek fareler (aynı zamanda yetişkin fareler gibi) el tarafından bastırılmış ve araştırmacı tarafından dik tutulmalıdır, inokulum (yetişkin fareler için 10 mikrolitrelik kadar bebek fareler için 3 mikrolitrelik) inokulum burun ve inhalasyon üzerine bırakılır gözlem tarafından doğrulanır.

3.2c yenidoğan farelerin, bakteri ya da virüs gerektiği şekilde yuva ve inokülasyon biri tarafından teker teker çıkarın. Halinde hemen gerekli ve dönüş hayvan kafesine geri kalıcı bir kalem kullanarak hayvanın kuyruk işaretleyin. Baraj yavrular yuvaya geri kabul edecek, böylece bazı yataklar malzeme ile hayvan ovalayın. Not: kalıcı bir kalem hayvanların hızla çıkıyor ve her gün yeniden uygulanabilir. Alternatif olarak, bir dövme sistemi bireysel hayvanları tanımlamak için kullanılıyor olabilir.

3.3 Biz 8 ila 14 günlük farelerden 3 bulaştırmak için 20 PFU grip Udorn/307/72 A virüsü (H3N2) kullanın. Hayvanlarda görülen mortalite ve morbidite S. zorlanma bağlıdır. pneumoniae ve influenza A virüsünün kullandı. Tablo 3, insani uç noktaları ve 21 gün yaş daha genç farelerde kullanmak müdahale kriterleri yararlı bir dizi sağlar. S. kullanırken, genellikle herhangi bir mortalite ve morbidite tespit yok pneumoniae EF3030 ve influenza A virüsü suşu Udorn/307/72 (H3N2) fareler> 10 gün.

Doğru olabilmesi için 4.2, fareler, anestezi çözüm enjeksiyonu önce tartılır olabilir. Bir rehber olarak, 50-75 hakkında mikrolitre anestezik solüsyonun 20 gün eski fareler için kullanılır. Fare kuyruğu ve arka bacak, bir tutam yanıt vermiyor tamamen uyuşturulduktan. IVIS iken, farelerin de, anestezi katacak izofluran maruz olacaktır. Fareler enfeksiyon görüntüleme zamanlama S. suşu (ler) bağlıdır. pneumoniae ve influenza A virüsünün ilgi belirtileri gibi. Bioluminescent görüntüleme zamanlamasını optimize etmek için birkaç pilot deneyler gerekli olabilir.

4.3 Fare ya bir izolasyon kutusu (kutuya girerken ya da çıkarken kirleticiler engeller) içine yerleştirilir veya alternatif olarak, doğrudan görüntüleme için araç içine yerleştirilmiş olabilir. Biz farelerin görüntüleme işlemi sırasında anestezi kalmasını sağlar ve S. ile IVIS kirlenmesini önlemek amacıyla, bebek fare ile deneyleri için izolasyon kutusunu kullanırsınız pneumoniae ve / veya influenza A virüsünün.

4.3 solunum yolu bir görüntü elde etmek için, farelerin bir ventral görüntüyü kullanın. Farenin lateral görüntü kulakları daha duyarlı bir görüntü sağlar.

Farelere doğrudan odasına yerleştirilen 4.4, izofluran farelerin burun konileri aracılığıyla teslim edilir. Burun konileri bebek fareler üzerinde uymaz bu yana bebek farelerin kullanıldığı deneyler için yalıtım kutusu tercih edilir.

4,5 TBir görüntü yakalamak için gerekli toplam maruz kalma süresi, bioluminescent sinyalinin gücüne göre deneyler arasında değişir sinyali, bakteri suşunun konumu ve fare suşu kullanılmaktadır. Ikincisi ile ilgili olarak, hem pigment ve kürk toplam saptanabilir sinyal önemli ölçüde azaltabilir. IVIS Spektrum kamera arka inceltilmiş, arkadan geniş bir dinamik aralık (65536 gri seviye) sunan CCD aydınlattı. İdeal olarak, maruz kalma süresi, 60 ve 60.000 arasındaki sayıları yakalamak için ayarlanmış olmalıdır. C57BL / 6 fareler ötesinde görüntüleme süresi 7 dakika artan deneyimi, belirgin bir sinyal gürültü oranı artırmak değildir. Bioluminescent sinyal artırmak için alternatif seçenekler binning derecesi (büyük yani) artırılması ve daha küçük bir görüş alanını kullanarak içerir. Önemlisi bu tespit edilen fotonların sayısı için göz ardı edilen bir değer sağlar, ölçme, doymuş piksel içeren görüntünün içinde alanlarda yapılabilir olmamalıdır. Optimal koşullar olarak emin değilseniz, otomatik pozlama özelliği bir kılavuz olarak kullanılabilir.

Bioluminescent güçlü bir sinyal fare bir parçası yakındaki bir bölgedeki biyoparlaklık algılama engelleyen ise, fare seçilmiş bölgelerde siyah kağıt ve görüntüleme ile kaplı olabilir 4,5 normal olarak devam edebilirsiniz

4.7 Işıklı sinyal fotonlar (sayılır karşı) görüntüleme koşullarında deneyler arasındaki farklılıkları (örneğin görüntüleme süresi) bioluminescent sinyal ölçüm etkilemez sayısal ise.

4.8 şekli aynı ilgi bölgenin, belirli bir bölgedeki fotonlar ölçmek için toplam akı kullanıyorsanız, tüm örnekler için kullanıldığından emin.

5.1a Fare araştırmacının ilgi bağlı olarak, influenza A virüsü ile enfeksiyon sonrası herhangi bir zaman noktasında ötenazi olabilir. Biz genellikle influenza A virüsünün Udorn/307/72 (H3N2) enfeksiyonu 6 gün sonra bakteriyel ve viral titre belirlemek ve herhangi bir mortalite / morbidite bakmazlar. Ancak, bu deneylerde morbidite ve mortalite S.pneumoniae bağlı olarak değişecektir ve influenza A virüsü suşu ve chosed bir zaman noktasında, hayvan refahı üzerindeki etkisini en aza indirmek için mortalite ve morbidite oranları dikkate almalıdır. Tablo 3, bu deneylerde kullanılmak üzere müdahale kriterler ve insancıl uç noktaları için yararlı bir rehber sağlar. Genellikle, fare, ötenazi ve doku in vivo bioluminescent görüntüleme sonra 3 saat içinde açıklandığı gibi işlenmiş .

Daha genç 10 gün eski 5.1b Fare hipoksiye dayanıklı ve dekapitasyon tarafından ötenazi. Açıklanan deney düzeneği, farelerin en az 14 gün ve CO ₂ boğulma ötenazi olabilir.

5.7 Kan agar plaklarına, nazal dokuların homojenatlarında sofrada yemek yiyen bakteri gelişimini engellemek için 5μg/ml gentamisin ile desteklenebilir. Dizi kullanılan dilüsyonlarının S. bağlıdır. pneumoniae suşu kullanılmaktadır. S. ile 20 günlük farelerden deneyleri için pneumoniae suşu EF3030, düzgün, 10e-1, 10e-2 ve 10e-3 kullanın.

Bir yedekleme örnek virüs plak tahlil halinde kullanılabilir, böylece en az iki alikotları homojenize doku 5.8 Store her numune,! Doğru bir viral titresi sadece örneklerden dondurma değil, tekrar tekrar dondurmak çözülmüş sonra bir kez çözdürülmelidir bir örneklem üzerinden elde edilebilir.

6.1% 90-100 konfluent yetiştirilen zaman, tek bir 150cm ² doku kültürü şişesi beş 6-kuyucuğu için yeterli MDCK hücreleri verecektir.

6.5 optimal seri seyreltme kullanılan virüs suşu ve enfeksiyon sonrası zaman bağlıdır. Genellikle, influenza A virüsü ile enfeksiyon 6 gün sonra alınan organı homojenatlarında düzgün, 10e-1 ve 10e-2 dilüsyonları kullanmak istiyorsunuz.

6.6 virüs stokunun seri dilüsyonları kullanımı her plak tayininde kullanımı için uygun bir pozitif kontrol. , RPMI + negatif kontrol olarak kullanılabilir.

8. Temsilcisi sonuçları:

Şekil 1 şematik embriyolu tavuk yumurtası.

Şekil 2 S. BLI pneumoniae, grip virüsü ile alay enfeksiyon sonrası 3 gün ve günde 4 fare bulaşmış .

Şekil 3 S. BLI pneumoniae ve influenza virüsü grip virüsü ile enfeksiyon sonrası 3. gün ve günde 4 ko-enfekte fare.

Şekil 4, tek bir burun Bakteriyel yük ve bir ko- enfeksiyonTed fare.

Şekil 5, ko-enfekte fare burun ve akciğer Viral titreleri .

Medya	Içindekiler
% 1.8 'lik (w / v) Agaroz	Agaroz 0.9 gram 50ml distile H 2 O, 121 ° C'de 10 dakika süreyle otoklav ile sterilize edin. 56 ° C su banyosunda soğuması için aktarın.
Çift gücü Leibovitz L15 orta (ds L15)	1 satchel L15 tozu (1L kadar), 450 ml steril distile H 2 O içinde çözülür ve eriyene kadar karıştırılır . 1M HCl ile pH 6.8 pH ayarlanır. Sonra NaHCO3 4ml 7% (w / v), 0.4mL Hepes (0,5 M, pH 6.8), 200 U / ml penisilin, 200 mg / ml streptomisin, 60 mg / ml gentamisin ile tamamlar. Sterilize 500ml ve filtre son ses seviyesini ayarlayın.
At Kan Agar (HBA)	% 4 HBA (Oxoid, Basingstoke, İngiltere), dH 2 O,% 7 (v / v) At Kan
RF10	RPMI-1640 2mm glutamin, 2NM sodyum piruvat, 24 mg / ml gentamisin, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin,% 10 (v / v) ısı ile inaktive edilmiş Fötal Buzağı Serumu içeren.
RPMI +	RPMI-1640 içeren 2mm glutamin, 2NM sodyum piruvat, 24 mg / ml gentamisin, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin
Todd-Hewitt Broth +% 0.5 maya özü	DH 2 O Todd Hewitt Broth (Oxoid, Basingstoke, Birleşik Krallık)% 2 (w / v) maya özü ile desteklenmiş

Tablo 1. Bu protokolde kullanılan özel medya.

Malzeme Adı	Tip	Şirket	Katalog Numarası	Yorum
RPMI medyum 1640	Reaktif	Gibco	21870-076
Tripsin	Reaktif	Worthington Biyokimyasal Şirketi	LS003740	TPCK tedavi
Leibovitz L-15 orta	Reaktif	Gibco	41300-039
Agaroz, tip I	Reaktif	Sigma-Aldrich	A6013	SeaPlaque agaroz gibi düşük ergime sıcaklığına agaroz, kullanın
Madin-Darby Canine Böbrek hücreleri	Reaktif	ATCC	CCL-34

Tablo 2: Özel reaktifleri ve ekipmanlar.

Hayvan refahı üzerinde etkisi
	Orta işaretleri Hafif	Şiddetli belirtiler b
Non-spesifik bir işaret (ler) :
Görünüm	Hiçbir dehidratasyon (cilt çadırlaşması) piloerection orta hafif	Dehidratasyon ile Piloerection, (cilt çadırlaşması)
Vücut Durum	daha az kilo alımı	No kilo alma veya kilo azalma
Davranış	Verememiş ama duyarlı, akranları ile etkileşim azaldı.	Yanıt Vermeyen faaliyet ve provokasyon. Diğer littermates İzole
Belirli koşullar ya da anormal klinik belirtisi (ler):
Süt spot olmaması (2-3 gün)	<24 saat gözlenmiştir varsa emzirme teşvik etmeye çalışın.	24-48 saat sonra bile cesaret süt spot hiçbir kanıt ya da açıkça suckled değil, ötenazi düşünürsek.
Diğer belirtiler	Hayvan, orta ya da şiddetli ağrı veya sıkıntı uygunsa eylem veya euthanise: Hayvan Tesis Müdürü / Laboratuvar Hayvan Veteriner tavsiye yeniden isteyin

Tablo 3. Bebek fareler (<21 gün) Müdahale kriterler:

günde iki kez gözlem sıklığını artırmak ve böylece tedavi ve bakım verilebilir uygun hayvan refahı görevlisi den yardım isteyin, bir veya daha fazla hafif, orta 'işaretleri görülmektedir.

^b bir veya daha fazla 'ciddi' işaretleri gözlenmektedir, fareler kullanarak euthaniseuygun bir yöntem. Fare <10 gün dekapitasyon ötenazi, fareler> 10 gün eski CO ₂ boğulma ötenazi.

Discussion

In vivo görüntüleme IVIS makine ile mikrobiyal patogenez ^{4, 6-9,} gerçek zamanlı görüntüleme sağlayan benzersiz bir metodoloji. Burada, S. arasında sinerjistik anlamak için bu teknolojinin uygulama bebek farelerde pneumoniae ve influenza virüsü. Bu tekniğin non-invaziv doğası nedeniyle, zaman içinde her bir fare enfeksiyon ilerlemesini izlemek mümkün olmuştur. Bu, bize ortak ev sahipliği bebek ^fareler 3 arasında pnömokok iletim kinetiği belge sağladı . Bu tekniğin non-invaziv doğası başına daha az sayıda deney hayvanları kullanmak için araştırmacılar sağlar ve dolayısıyla hayvan kullanımını azaltmak. Bu enfeksiyonun yayılması görselleştirmek, vücutta enfeksiyon önceden bilinmeyen sitelere kolayca diseksiyon (örneğin orta kulak gibi) tarafından örneklenmiş olmayan sitelerin yanı sıra IVIS makine kullanmak da mümkündür.

Görüntüleme deneyler başlamadan önce, biz bioluminescent EF3030 gerginlik kolonizasyon düzeyleri doku homojenatlarında canlı sayımı numaralandırma ebeveyn EF3030 gerginlik kolonizasyon düzeyleri ile karşılaştırılabilir olduğunu doğruladı. Buna ek olarak, ilk kez grip virüsü ile enfeksiyon nazofarenks bioluminescent EF3030 artan yük ana EF3030 suşu (sonuçlar gösterilmemiştir) ile gösterildiği gibi hayvanların kolonize doğruladı.

IVIS teknoloji kullanımı kolay ve tekrarlanabilir ve kolay veri anlamak için üretir iken, deney, teknoloji duyarlılık ve yardımcı dikkatle maksimize olduğu şekilde tasarlanmış olmalıdır. Örneğin, IVIS kameranın hassasiyetini doku deneyimlerimiz, akciğerlerde kaynaklanan bioluminescent sinyaller için tespit sınırı artırır ^8, derinliği ve donukluk tarafından etkilenir. Buna ek olarak, koyu kürk ve pigmentli cilt kadar ⁸ tüysüz fareleri göre 10 kat olarak ışık geçirgenliği azaltır. Bu yöntem geliştirirken, biz bu protokolü 5 ila 14 günlük C57BL / 6 fareler ile kullanmak için optimize etmiş ve o zamandan beri IVIS bioluminescent S. ile 20 gün eski C57BL / 6 farelerin kolonizasyonu tespit etmek için kullanılan olabileceğini göstermiştir pneumoniae EF3030. Ancak, bu deneyler, çıplak ya da BALB / c farelerde yapılmaktadır sinyal algılama artabilir. Bununla birlikte, IVIS kamera, monitör, karakterize ve sonuçta, influenza A virüs enfeksiyonu, pnömokok hastalığına in vivo gelişimi anlamak için yeni bir yaklaşım temsil eder.