Summary
Вестерн-блоттинга является аналитический метод используется для обнаружения специфических белков в данном образце гомогената ткани или экстракта.
Abstract
Вестерн-блоттинга является аналитический метод используется для обнаружения специфических белков в данном образце гомогената ткани или экстракта. Он использует гель-электрофореза для разделения нативных или денатурированных белков длина полипептид (денатурирующих условиях) или 3-D структуры белка (родной / не денатурирующих условиях). Белки затем переведен в мембране (обычно нитроцеллюлозы или PVDF), где их опроса (обнаружен), используя антитела, специфичные к белку-мишени.
Protocol
1. Подготовка образцов
Первый шаг в западных промокательной является пробоподготовки. Для подготовки образцов для запуска геля клетки и ткани должны быть лизируются для освобождения белков, представляющих интерес.
- Удобный, готовый к использованию реагента, который является универсальным и простым в использовании для извлечения растворимого белка CytoBuster или PhosphoSafe. Эти добычи буферы содержат моющие средства оптимизированы для эффективного извлечения растворимых белков млекопитающих и клетки насекомых. Нежный, без ионного состава CytoBuster реагента извлечения белка позволяет изоляции функционально активных эндогенных или выразили белков без необходимости вторичной очистки, такие как ультразвуком или замораживания / оттаивания. PhoshoSafe имеет дополнительное преимущество, содержащий четыре ингибиторов фосфатазы.
- Гранул клеток центрифугированием низкой скорости (например, 5 мин при 2500 мкг), процедить осадок клеток хорошо.
- Ресуспендируют клеток в CytoBuster белка Добыча реагента использовании 150 мкл на 10 6 клеток (оптимальное количество реагента CytoBuster извлечения белка может меняться в зависимости от размера ячейки).
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Трансфер в подходящую трубку и спина в течение 5 мин при 16 000 мкг при 4 ° C.
- Передача очищается супернатант (клеточного экстракта) в новую пробирку и приступить к анализу.
- Для специализированных извлечения белка, мы рекомендуем использовать наши высококачественные ProteoExtract Kits. EMD имеет более десятка наборов для митохондриальных изоляции, субклеточном добычи протеома, добыче трансмембранного белка, и многие другие. Пожалуйста, посетите наши западные целевую страницу пятном для дальнейших подробностей.
- EMD также продает широкий спектр протеаз и фосфатазы наборов ингибитор коктейль. Как только происходит лизис, протеолиз, дефосфорилирование, и денатурация начать. Эти события могут быть замедлены чрезвычайно если образцы хранятся на льду или при температуре 4 ° С во все времена и соответствующие ингибиторы добавляют в свежем виде лизис буфера. Пожалуйста, посетите наши западные целевую страницу пятном для дальнейших подробностей.
2. SDS-PAGE
Второй шаг в западных промокательной является разделения белков. Белки отделить на основе молекулярной массой.
- Вы можете сделать свой собственный геля ПААГ, однако мы будем использовать коммерчески сборных геля.
- После подготовки образца, вы готовы для определения концентрации белка. EMD имеет два набора для этого, чтобы измерять концентрацию, один из которых без Вмешательство белка Kit пробирной, а другой Пробирной BCA белка Kit.
- Как только концентрация белка оценивается мы готовы подготовить нашу выборку для загрузки геля. Антитела обычно признают небольшую часть белок (именуемые эпитопа), и этот домен может находиться внутри 3D конформации белка. Чтобы разрешить доступ антитела к этой части надо разворачиваться белка.
- Для денатурации, используйте загрузки буфера с анионными денатурирующих моющего средства додецилсульфата натрия (SDS), и кипятить смесь на 95-100 ° С в течение 5 минут. Легкой и удобной погрузки буфер для использования 4X буфера проб.
- Поместите первую полосу хорошо Трейл маркерный белок Mix. Этот маркер имеет три ссылки полосы, которые позволяют контролировать электрофореза. Когда гель испачкается, 10 полос видны в пределах от 10-225 кДа.
- Заполните электрофореза единицы проточной буфера. Для PAGE гелей, это, как правило 1X Трис-глицин. Для получения подробных рецептов буфера, посетить Западную промокательной странице. EMD предлагает высококачественные буферами реагентов с нашей линии химического OmniPur. Выполнить геля при 220 В в течение 1 часа.
- Как только белки разделены, пятно геля Кумасси синий обеспечить белки мигрируют ровно и равномерно. RAPIDstain является сверхчувствительных пятно, которое готово к использованию. Нет destaining не требуется.
3. Белка-переносчика
Так же, как белки с электрическим зарядом могут быть вызваны путешествовать по геля в электрическом поле, так что может быть передано белков в электрическом поле из геля на мембрану, быть или PVDF или нитроцеллюлозы.
- Сегодня мы будем делать мокрой передачи. В мокрых передачи, гель и мембрана зажаты между губкой и бумаги (губки / бумага / гель / мембрана / бумага / губка) и все зажаты плотно вместе после того, гарантируя, что ни воздушные пузыри образовались между гелем и мембраной. Сэндвич погружен в передаче буфера для которых электрические поля. Отрицательно заряженные белки путешествия к положительно заряженному электроду, но мембрана останавливает их, связывает их и не позволяет им продолжать далее.
- Два типа мембран доступны: нитроцеллюлоза и PVDF. И работать хорошо. Сегодня мы будем использовать PVDF. PVDF мембраны требуют замачивания в метанол в течение нескольких минут, а затем ледяной буфера передачи в течение 5 минут. Гель также необходимо, чтобы уравновесить в течение нескольких минут в ледяной буфер передачи. Невыполнение этого требования может сократиться гель при передаче.
- Буфера для влажной передачи 1X Трис-глицин, с 20% метанола. Подробная подготовка буфера доступны на нашем сайте.
- После завершения передачи, это хорошая идея, чтобы визуализировать белки, чтобы гарантировать даже передачи без каких-либо воздушных карманов. Это можно легко сделать с Blot RedAlert Западной пятно. Это пятно является готовой к использованию и destaining можно легко сделать с водой.
4. Антитела и аксессуаров Реагенты
- Первым шагом в этом зондирования и антитела к антигену, чтобы блокировать мембраны. Блокировка мембрана предотвращает неспецифическую фоне обязательными.
- Либо обезжиренного молока или БСА может быть использован как блокирование решения. Однако при использовании фосфорно-специфические антитела, это не рекомендуется использовать молоко, то это вызовет высокий фон.
- EMD предлагает несколько высококачественных блокирование реагентов, в том числе SeaBlock, которая не является млекопитающим блокирующий агент и промокните QuickBlocker, который готовят, готовый к использованию блокирующий агент. У нас также есть высококачественные BSA (доля V) имеется.
- Инкубируйте мембраны 1 час при комнатной температуре, при легком волнении.
- Вымойте три раза в TBST или PBST после инкубации. Легкий и удобный способ сделать TBST или PBST является использование нашего таблетки (PBS ТВИН Таблетки / TBS ТВИН таблетки)
- Как только мембрана была заблокирована, вы готовы для инкубации с первичными антителами. EMD года предлагает полный портфель исключительных антител с лучшими антител гарантии в промышленности на протяжении более 30 лет. Помните, что все антитела EMD, мы предлагаем полный 100% без риска гарантии. Покупка антитела и использовать его для любых видовой специфичности или приложения вы хотите. Если антитела не работает, чтобы Вы остались довольны, мы предоставим полный кредит, который будет использоваться на любой другой продукт. Для более подробной информации, пожалуйста, посетите наши западные промокательной веб-страницы.
- Сегодня мы будем инкубации нашей главной антител при решении 1 из SignalBoost. SignalBoost большой продукт, позволяющий вашему сигналу быть существенно увеличены. Просто инкубируйте ваших первичных антител в растворе 1 и инкубировать в течение 1 часа или, как вы это обычно делаете. Существует нет необходимости добавить дополнительные блокаторов. Кроме того, вы можете использовать BSA или обезжиренное сухое молоко, как блокирующий агент.
- Промыть TBST. Мы делаем TBST использованием готовых к растворяются TBST таблетки.
- Инкубируйте ваших вторичных антител при решении 2 из SignalBoost. Инкубируйте вторичные антитела в блокирующем буфере в течение 1 часа. Вымойте мембраны еще несколько раз с TBST.
5. Обнаружение
Для сопряжения HRP вторичными антителами, ECL традиционно используется. Отличные ECL реагента мы предлагаем RapidStep. Преимущества RapidStep в том, что нет смешивания просвета или усилитель не требуется. Просто распылите мембраны несколько раз, и развивать с помощью рентгеновской пленки. RapidStep предлагает низкую чувствительность пиктограмма, а также излучать свет в течение 2 часов после того субстрата.
Discussion
В этом видео-презентации, мы выделили основные шаги в западных промокательной которые пробоподготовки, SDS-PAGE, мембранные блокировка / зондирования с антителами, и обнаружения. За каждый шаг процесса, надлежащего протоколы и соответствующие реагенты должны быть использованы для достижения высоких результатов.
Disclosures
Авторы Анна и Джесси Эслами Лухан являются сотрудниками EMD химических Inc, которая производит реактивы и инструменты, используемые в настоящей статье.
Materials
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. 'W. estern blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Ambroz, K. Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis. , (2006).
- Quan, Z. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells. Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).
- O'Malley, D. ervia Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors. Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).
