Summary
Western blotting è una tecnica analitica utilizzata per rilevare le proteine specifiche in un dato campione di tessuto omogenato o estratto.
Abstract
Western blotting è una tecnica analitica utilizzata per rilevare le proteine specifiche in un dato campione di tessuto omogenato o estratto. Utilizza elettroforesi su gel per separare le proteine nativo o denaturato dalla lunghezza del polipeptide (condizioni di denaturazione) o dalla struttura 3-D della proteina (nativo / non-denaturazione condizioni). Le proteine sono poi trasferiti ad una membrana (solitamente di nitrocellulosa o PVDF), dove viene effettuato il controllo (rilevato) con anticorpi specifici per la proteina bersaglio.
Protocol
1. Preparazione del campione
Il primo passo nella Western blotting è la preparazione del campione. Per preparare i campioni per l'esecuzione di un gel di cellule e tessuti devono essere lisate per rilasciare le proteine di interesse.
- Un comodo, pronto a utilizzare il reagente che è versatile e facile da usare per l'estrazione delle proteine solubili è CytoBuster o PhosphoSafe. I buffer di estrazione contengono detergenti ottimizzate per l'estrazione efficiente di proteine solubili dalle cellule dei mammiferi e insetti. Il dolce, non ionici composizione del reagente di estrazione proteine CytoBuster consente l'isolamento di funzionalmente endogena attiva o proteine espresse senza la necessità di un trattamento secondario come sonicazione o di gelo / disgelo. PhoshoSafe ha il vantaggio di contenere quattro inibitori della fosfatasi.
- Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a bassa velocità (ad esempio 5 min a 2500 xg), scolare il pellet bene.
- Risospendere le cellule in reagente di estrazione delle proteine CytoBuster utilizzando 150 microlitri per 10 6 cellule (quantità ottimale di reagente di estrazione proteine CytoBuster possono variare in base alla dimensione della cella).
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Trasferire in un tubo adatto e girare per 5 min a 16000 xga 4 ° C.
- Trasferimento cancellato surnatante (estratto cellulare) in una nuova provetta e procedere con l'analisi.
- Per l'estrazione di proteine specializzate, si consiglia di utilizzare il nostro Kit ProteoExtract di alta qualità. EMD ha più di una dozzina di kit per l'isolamento dei mitocondri, estrazione proteomica subcellulare, l'estrazione di proteine transmembrana, e molti altri. Visitate la nostra pagina di destinazione occidentale blot per ulteriori dettagli.
- EMD vende anche una grande varietà di proteasi e fosfatasi set cocktail inibitore. Non appena si verifica la lisi, proteolisi, defosforilazione e denaturazione iniziare. Questi eventi possono essere rallentato enormemente se i campioni sono conservati in ghiaccio o a 4 ° C in ogni momento e gli inibitori appropriati vengono aggiunti allo stato fresco al tampone di lisi. Visitate la nostra pagina di destinazione occidentale blot per ulteriori dettagli.
2. SDS-PAGE
Il secondo passo Western blotting è la separazione delle proteine. Le proteine sono separate in base al peso molecolare.
- Potete fare i vostri gel propria pagina, ma useremo un normale pre-cast gel.
- Dopo aver preparato il campione, si è pronti per determinare la concentrazione di proteine. EMD ha due kit per questo per misurare la concentrazione, una è il non-interferenti kit di analisi delle proteine e l'altro è il kit BCA Protein Assay.
- Una volta che la concentrazione di proteine è valutata siamo pronti a preparare il nostro campione per il caricamento del gel. Gli anticorpi riconoscono tipicamente una piccola porzione della proteina di interesse (denominato epitopo) e questo dominio può soggiornare nel conformazione 3D della proteina. Per abilitare l'accesso degli anticorpi a questa parte, è necessario dispiegare la proteina.
- Per denaturare, utilizzare un tampone di caricamento con la anionici denaturazione dodecil solfato di sodio detergente (SDS), e fate bollire il composto a 95-100 ° C per 5 minuti. Un buffer di caricamento facile e comodo da usare è Sample Buffer 4X.
- Caricare il vicolo prima bene con Marker Proteine Trail Mix. Questo indicatore ha tre fasce di riferimento che permettono di monitorare l'elettroforesi. Quando il gel è macchiato, 10 sono visibili le bande che vanno 10-225 kDa.
- Riempire l'apparecchio con la gestione del buffer di elettroforesi. Per i gel PAGINA, questo è di solito 1X Tris-glicina. Per le ricette di buffer dettagliate, visitare la pagina Western blotting. EMD offre alta qualità tamponi reagenti con la nostra linea di prodotti chimici OmniPur. Attivare il gel a 220V per 1 ora.
- Una volta che le proteine si sono separati, macchia il gel con Coomassie blu per garantire le proteine sono migrati in modo uniforme e uniformemente. RAPIDstain è un ultra-sensibile macchia che è pronto per l'uso. Decolorazione non è richiesto.
3. Proteina di trasferimento
Proprio come le proteine con una carica elettrica può essere indotto a viaggiare attraverso un gel in un campo elettrico, in modo le proteine possono essere trasferiti in un campo elettrico dal gel su una membrana, essendo o PVDF o nitrocellulosa.
- Oggi faremo un trasferimento bagnato. Nel trasferimento bagnato, il gel e la membrana sono inseriti tra spugna e carta (spugna / carta / gel / membrana / carta / spugna) e tutti sono serrate insieme dopo garantendo l'assenza di bolle d'aria si sono formate tra il gel e la membrana. Il panino è immerso in buffer di trasferimento a cui è applicato un campo elettrico. Le proteine cariche negativamente viaggio verso l'elettrodo di carica positiva, ma la membrana li ferma, li lega, e impedisce loro di continuare.
- Due tipi di membrane sono disponibili: nitrocellulosa e PVDF. Entrambi funzionano bene. Oggi useremo PVDF. Membrane PVDF richiedono ammollo in methanol per pochi minuti, seguito da buffer di trasferimento di ghiaccio freddo per 5 minuti. Il gel ha anche bisogno di equilibrare per pochi minuti in buffer di trasferimento ghiacciata. Non farlo può ridurre il gel durante il trasferimento.
- Il buffer per il trasferimento bagnato è 1X Tris-glicina con il 20% di metanolo. Preparazioni di buffer dettagliate sono disponibili sul nostro sito web.
- Una volta completato il trasferimento, è una buona idea per visualizzare le proteine per assicurare anche il trasferimento senza sacche d'aria. Questo può essere fatto facilmente con RedAlert Western Blot Stain. Questa macchia è pronto per l'uso e decolorazione può essere fatto facilmente con l'acqua.
4. Anticorpi e reagenti accessori
- Il primo passo per fare di sondaggio e di anticorpi contro l'antigene è quello di bloccare la membrana. Bloccando la membrana impedisce legame aspecifico di fondo.
- In entrambi i casi non grassi del latte o BSA può essere utilizzato come soluzione di blocco. Tuttavia, quando si usa fosfo-specifici anticorpi, non è raccomandato l'uso di latte in quanto causerà fondo elevato.
- EMD offre diversi reagenti blocco di alta qualità, tra cui SeaBlock, che è un non-mammiferi agente bloccante e QuickBlocker BLOT, preparato, pronto per l'uso di blocco degli agenti. Abbiamo anche di alta qualità BSA (Frazione V) disponibili.
- Incubare la membrana 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione.
- Lavare tre volte in TBST o PBST dopo l'incubazione. Un modo semplice e conveniente per fare TBST o PBST è quello di utilizzare il nostro compresse (PBS TWEEN compresse / compresse TWEEN TBS)
- Una volta che la membrana è stata bloccata, si è pronti per incubare con l'anticorpo primario. EMD ha offerto un portafoglio completo di anticorpi eccezionale con la garanzia migliore di anticorpi nel settore da oltre 30 anni. Ricorda che tutti gli anticorpi EMD, offriamo una completa al 100% senza rischio di garanzia. Acquisto di un anticorpo e usarlo per qualsiasi specificità di specie o applicazione che si desidera. Se l'anticorpo non funziona in modo soddisfacente, si fornirà un credito pieno per essere utilizzato su qualsiasi altro prodotto. Per maggiori dettagli, visitate la nostra pagina web occidentale blotting.
- Oggi ci sarà incubando il nostro anticorpo primario usando la soluzione di 1 di SignalBoost. SignalBoost è un ottimo prodotto che permette il segnale di essere migliorato in modo significativo. È sufficiente incubare la tua anticorpo primario in Soluzione 1 e incubare per 1 ora o come si farebbe normalmente. Non c'è bisogno di aggiungere ulteriori agenti di blocco. In alternativa, è possibile utilizzare BSA o latte scremato secco come un agente bloccante.
- Lavare con TBST. Facciamo TBST con il ready-to-tablet sciogliere TBST.
- Incubare il tuo anticorpo secondario utilizzando la soluzione 2 di SignalBoost. Incubare l'anticorpo secondario nel tampone di bloccaggio per 1 ora. Lavare la membrana più volte con TBST.
5. Rivelazione
Per HRP coniugando anticorpi secondari, ECL è tradizionalmente utilizzato. Di un reagente eccellente ECL che offriamo è RapidStep. I vantaggi di RapidStep sono che nessuna mescolanza di luminale o enhancer è richiesto. Basta spruzzare la membrana un paio di volte e sviluppare con x-ray film. RapidStep offre una bassa sensibilità pittogramma così come la luce che emettono fino a 2 ore dopo l'aggiunta del substrato.
Discussion
In questo video di presentazione, abbiamo evidenziato i passaggi principali in Western blotting che sono la preparazione del campione, SDS-PAGE, membrana blocco / sondaggio con gli anticorpi, e la rilevazione. Per ogni fase del processo, i protocolli di corretta e reagenti appropriati dovrebbero essere usati per ottenere risultati di alta qualità.
Disclosures
Gli autori Anna Eslami e Jesse Lujan sono impiegati da EMD chimici Inc che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.
Materials
References
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