Summary
Se describe un nuevo método para llevar a cabo la replicación del ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Convección térmica se aprovecha de los reactivos de transporte continuo entre la desnaturalización, hibridación, extensión y condiciones por el mantenimiento de las superficies opuestas del reactor a temperatura constante. Este diseño inherentemente simples promesas para hacer un rápido PCR más accesible.
Abstract
Muchos ensayos de biología molecular dependen de alguna manera en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una muestra de ADN diana inicial se diluye a una concentración detectable. Pero el diseño de hardware convencionales termociclado PCR, en su mayoría sobre la base de enormes bloques de metal de calefacción, cuya temperatura es regulada por los calentadores de termoeléctricas, limita la velocidad de reacción alcanzables 1. Capacidad eléctrica es necesaria para calentar y enfriar repetidas veces la mezcla de reactivos, lo que limita la capacidad de implementar estos instrumentos en un formato portátil.
Convección térmica ha surgido como un enfoque alternativo termociclado prometedor que tiene el potencial para superar estas limitaciones 2-9. Flujos convectivos son una ocurrencia diaria en una gran variedad de escenarios que van desde la atmósfera de la Tierra, los océanos, y el interior, a las lámparas de lava decorativa y colorida. El movimiento del fluido se inicia de la misma manera en cada caso: a la inestabilidad de flotabilidad impulsado surge cuando un volumen limitado de líquido es sometido a un gradiente de temperatura espacial. Estos mismos fenómenos constituyen un medio atractivo para realizar termociclado PCR. Mediante la aplicación de un gradiente de temperatura estática a través de una geometría del reactor se diseñan adecuadamente, un continuo flujo circulatorio se puede establecer que en repetidas ocasiones que el transporte a través de reactivos de PCR zonas de temperatura asociado a la desnaturalización, hibridación, y las fases de extensión de la reacción (Figura 1). Termociclado por lo tanto, se puede accionar de una manera pseudo-isotérmica simplemente sosteniendo dos superficies opuestas a una temperatura fija, eliminando la necesidad de calentar y enfriar repetidamente el instrumento.
Uno de los principales desafíos que enfrenta el diseño de termocicladores convección es la necesidad de controlar con precisión la velocidad espacial y distribución de la temperatura dentro del reactor para asegurarse de que los reactivos de forma secuencial ocupan las zonas de temperatura correcta para un período de tiempo suficiente 10,11. A continuación se describen los resultados de nuestros esfuerzos para investigar el 3-D y la velocidad de distribución de la temperatura en el micro de convección termocicladores 12. Inesperadamente, se ha descubierto un subconjunto de las trayectorias de flujo de complejos que son muy favorables para PCR debido a una combinación sinérgica de (1) intercambio continuo entre las líneas de flujo que ofrece una mayor oportunidad para los reactivos para probar toda la gama de perfiles de temperatura óptima, y ( 2) aumento del tiempo dedicado en la zona de temperatura de extensión de la limitación de velocidad de paso de la PCR. Extremadamente rápidos tiempos de amplificación de ADN (de menos de 10 min) se pueden conseguir en los reactores diseñados para generar esos flujos.
Protocol
1. Diseño básico de la convección termociclador
- Hemos construido un sencillo dispositivo que consta de ciclos térmicos convectivo intercambiables de plástico reacción de la cámara "cartuchos" que se encuentra entre dos placas de aluminio, cuya temperatura se controla de forma independiente 7 (Figura 2).
- Pozos cilíndricos reactor están integrados por conjuntos de mecanizado de agujeros en los bloques de policarbonato, con diferentes combinaciones de diámetro del agujero y espesor de la lámina de plástico empleadas para lograr las relaciones de aspecto que desee (altura / diámetro = h / d). Dos geometrías diferentes reactor se consideran en los resultados presentados aquí: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 l de volumen; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 l volumen.
- La superficie del fondo del reactor se calienta con un bloque de aluminio que contiene los calentadores de cartucho de interfaz con un controlador de temperatura microprocesser impulsada.
- La temperatura en la superficie superior del reactor se regula con un bloque de aluminio conectado a un baño de agua de recirculación.
- Todo el conjunto se fija mediante tornillos de nylon para limitar la conducción térmica entre los bloques de aluminio de oposición.
2. Preparación y carga de la mezcla de reacción PCR
- Un típico de 100 l mezcla de reacción contiene 10 l de solución tampón 10x, 6 l de 25 mM MgCl 2, 10 l de dNTPs (2 mM cada uno), 41,2 l de agua desionizada, 10 l de β-actina de la sonda, 10 l de β -actina cebador, 10 L de primer inversa β-actina, 2 l de ADN genómico humano plantilla (10 ng / l) y 0,8 l de ADN polimerasa KOD (2,5 unidades / l).
- Antes de cargar los reactivos, sellar la superficie inferior de la cámara de PCR utilizando una delgada lámina de cinta de aluminio.
- Lave los pocillos con un reactor de 10 mg / ml de solución acuosa de albúmina de suero bovino seguido por la lluvia-X Anti-Fog.
- Reactivos pipeta en los pozos de reactor con tiempo de carga de gel puntas de pipeta y sellar la superficie superior con cinta de teflón FEP.
3. Ejecución de la reacción en el termociclador convectiva
- Antes de iniciar la reacción, precalentar los dos bloques de aluminio a la temperatura deseada de la superficie superior e inferior.
- Sandwich del reactor de plástico cargado con reactivos de PCR entre los bloques de aluminio para calefacción, y rápidamente apretar el montaje mediante tornillos de nylon.
- Después de la reacción ha tenido lugar durante el tiempo deseado, apagar los calentadores y el lugar más bajo (caliente) la superficie del dispositivo en la parte superior de un bloque de metal enfriada rápidamente para que se enfríe y detener el flujo de convección.
- Retire el reactor de plástico y una pipeta de los productos de las fuentes (con las puntas de gel de carga de largo) para su posterior análisis.
4. Realizar un análisis de electroforesis en gel
- Prepare un 2% en peso de gel de agarosa al calentar 10 g de agarosa con 500 ml de solución tampón 1x en un plato caliente revolviendo hasta que la solución se aclare.
- Cargar el gel de agarosa en la bandeja de fundición e insertar el peine. Deje que el conjunto de gel de ~ 30 min.
- Retirar el peine y añadir 1x tampón TAE hasta que el gel se sumerge.
- Muestras teñidas con fluorescencia de ADN contienen 2 l 100x SYBR Green solución que, dos muestras de ADN l, 2 l colorante de carga 6x Orange, y 4 l buffer TAE.
- Añadir las muestras de ADN en los pocillos y ejecutar la separación de 60 V durante 1 h con un marcador de 100 bp de ADN escalera de tamaño.
- Quitar el gel y la fotografía bajo la luz UV para obtener el resultado.
5. Los resultados representativos:
Diseño óptimo de termocicladores convección consiste en elegir la correcta geometría del reactor que generará un flujo circulatorio, capaz de transportar los reactivos a través de las temperaturas clave que participan en el proceso de PCR. Los parámetros geométricos que se pueden variar en los reactores cilíndricos aquí consideradas son la altura (h) y diámetro (d), o equivalentemente la relación de aspecto (h / d). Hemos explorado los campos de flujo 3-D dentro de convección reactores de PCR en un rango de diferentes relaciones de aspecto utilizando la dinámica de fluidos computacional (CFD), y encontró que los patrones complejos pueden surgir inesperadamente. Más importante aún, nuestro análisis ha descubierto un subconjunto de estos campos de flujo complejo que aceleran de manera significativa la reacción 12.
Estos efectos geométricos se puede ver claramente al comparar los campos de flujo en reactores de relaciones de aspecto de alta y baja. En el caso de la relación de aspecto de alto (h / d = 9; un cilindro alto y delgado), los elementos del fluido son advección a lo largo de trayectorias que trazan los caminos que son esencialmente circuitos cerrados, y que están encerrados en seguir el mismo camino durante largos períodos de tiempo (Figura 3a). En consecuencia, hay pocas oportunidades para el intercambio entre ftrayectorias bajas que exponga los reactivos a la secuencia óptima de las condiciones térmicas de PCR (que oscila entre el recocido y la desnaturalización extremos en las superficies superior e inferior del reactor) y el conjunto más grande de trayectorias restantes que no contribuyen a la amplificación (localizada cerca del centro del reactor).
El campo de flujo es muy diferente a una relación de aspecto menor (h / d = 3, un menor, el cilindro más amplio), cada vez más caótica en el sentido de que las trayectorias líquido elemento ya no siguen los caminos cerrados (Figura 3b). Por lo tanto, a pesar de que los reactivos son sometidos a un perfil de temperatura más complejo, los elementos del fluido son capaces de explorar un rango más amplio de las trayectorias de modo que más del volumen de reactivo tiene una oportunidad para una óptima experiencia de perfiles térmicos. Estos resultados sugieren que mientras que contraintuitivamente trayectorias de flujo individual en h / d = 09 de mayo parecen ser más favorables para la PCR mediante la producción de perfiles de temperatura que "look" similar al empleado en un termociclador convencional, la naturaleza caótica del campo de flujo en h / d = 3 en última instancia, domina a escala mundial mediante la promoción de un mayor intercambio para que los reactivos no quedar atrapados en las trayectorias desfavorables por mucho tiempo.
Para probar esta hipótesis y determinar que la geometría del reactor era más favorable para la PCR, se utilizaron dos de ellos para realizar la replicación de PCR de 295 pb un objetivo asociado con el gen de la β-actina de una plantilla de ADN genómico humano. Notablemente, de manera rutinaria lograr la amplificación del producto de destino correcto en sólo 10 minutos a h / d = 3 (Figura 4a), mientras que la misma reacción que requiere por lo menos 20 minutos antes de detectarse productos se observaron en h / d = 9 (Figura 4b) . La especificidad de la reacción es mucho mayor en h / d = 3, en un solo producto de PCR se obtiene, mientras que varios productos no específicos se generan en h / d = 9, donde las trampas de campo de flujo de fluidos en los elementos desfavorables trayectorias térmicas durante largos períodos de tiempo.
Figura 1. Convección térmica en una cámara cilíndrica cuya parte superior e inferior superficies se mantienen a diferentes temperaturas fijas. Si la temperatura en la superficie inferior es mayor que en la parte superior, un gradiente de densidad vertical se establece en el líquido cerrado que es capaz de generar un patrón de flujo circulatorio. Con la elección correcta de los parámetros geométricos (altura h y diámetro d), el campo de flujo de convección se puede aprovechar para accionar termociclado PCR cuando las superficies superior e inferior son manintained cerca de recocido y desnaturalización de las temperaturas, respectivamente (la gravedad actúa verticalmente hacia abajo).
Figura 2. (A) Los componentes clave de un flujo convectivo termociclador de PCR. Un cartucho de reactor consiste en un bloque de policarbonato que contiene una serie de cámaras cilíndricas. El bloque se encuentra entre una placa superior diseñado para ser conectado a un baño de agua circulante y una placa inferior que incorpora calentadores integrados. (B) los reactivos de PCR se han cargado y sellado en el interior del cartucho de reactor, después de que el dispositivo está montado para llevar a cabo la reacción. Al terminar, el procucts puede ser fácilmente pipeta para un análisis posterior.
Figura 3. Simulaciones computacionales de 3-D los campos de flujo de convección generadas dentro de los reactores cilíndricos, con temperaturas de 53 y 96 ° C impuestas en las superficies superior e inferior, respectivamente. Los resultados se muestran en relaciones de aspecto de (a) h / d = 9 (38,2 l volumen del reactor) y (b) h / d = 3 (18,5 l volumen del reactor). Un representante trayectoria seguida por un elemento de fluido viaja a través del campo de flujo en 3D se muestra a la izquierda junto con las proyecciones vista superior y lateral de la ruta, la gráfica correspondiente de la temperatura en función del tiempo después de un elemento de fluido se muestra a la derecha. El perfil térmico en h / d = 9 aparece próxima a la de un termociclador convencional, pero el campo de flujo caótico en h / d = 3 es contraintuitivamente más favorable para la PCR.
Figura 4. Los resultados de la replicación del ADN obtenido en las geometrías del reactor se muestra en la Figura 3 (superior e inferior de las superficies se mantuvieron en 53 y 96 ° C, respectivamente). (A) PCR se acelera en h / d = 3, como es evidente por los productos de fuerte y visible después de tan sólo 10 minutos de tiempo de reacción (M: escalera de 100 pb, carriles 1-4: los productos de las reacciones en paralelo en 4 diferentes cámaras cilíndricas). (B h / d = 9 requiere por lo menos 20 minutos antes de que los productos visibles se observan, y varias bandas son la replicación del ADN evidente que indica que no son objeto específico, además del producto deseado (M: escalera de 100 pb, carriles 1-2: los productos de las reacciones en paralelo en dos cámaras cilíndricas diferentes).
Discussion
La interacción entre el flujo y la reacción química puede cambiar drásticamente bajo la influencia de la advección caótica. Pero estos estados de flujo complejas son difíciles de estudiar, sobre todo en geometrías 3D realista donde los efectos se vuelven importantes. Rayleigh-Bénard convección en h / d> 1, no sólo proporciona una plataforma conveniente para explorar estos fenómenos, su aplicación para realizar PCR también permite el acoplamiento entre las reacciones químicas y el flujo que se probaron. Esta capacidad única permite seleccionar los estados de flujo óptimo en el acto de efectos caóticos (contraintuitivamente) para acelerar la velocidad de replicación del ADN.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nosotros agradecemos a T. Ragucci, Watkins B., S. Wong, y Wallek B. en Lynntech, Inc. para asistencia técnica y muchas discusiones útiles. Este trabajo fue apoyado por los EE.UU. National Science Foundation (NSF) en virtud de concesión CBET-0933688.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase kit | Novagen, EMD Millipore | 71085-3 | |
| TaqMan β-actin Control Reagents kit | Applied Biosystems | 401846 | |
| Aluminum tape | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rain-X Anti-Fog | SOPUS Products | ||
| Long Gel-loading Pipette Tips | Fisher Scientific | 05-408-151 | |
| FEP Teflon tape | McMaster-Carr | 7562A17 | |
| Agarose gel | Bio-Rad | 161-3107 | |
| TAE running buffer | Bio-Rad | 141-0743 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | |
| 6x Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 100 bp DNA ladder sizing marker | Bio-Rad | 170-8202 |
References
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